田蓟苷-磷脂酰胆碱复合物的制备及其体内药动学研究

尚曙玉， 张铁山， 杨 娟， 刘勇华

(黄河科技学院，河南 郑州 450005)

田蓟苷是从唇形科香青兰属植物香青兰DracocephalummoldevicaL.中提取得到的黄酮类活性成分[1]，具有降低冠脉血管阻力、抗肿瘤、保护心肌缺血/再灌注损伤、降血脂、脂肪肝、抗冠心病等药理活性[2-4]，在防治心脑血管疾病方面应用前景广阔，但该成分水溶性、脂溶性均较差[5-6]，灌胃给药后绝对生物利用度仅为1.35%[7]，不利于其药效充分发挥。目前，已报道的田蓟苷相关剂型有固体分散体[6]、纳米粒[8]等。

药物与磷脂(主要是磷脂酰胆碱)形成复合物后，前者水溶性、脂溶性均可提高，也能为改善其生物利用度奠定基础[9-10]；后者是一种混合物，主要包括磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱等[11-12]，但溶血磷脂酰胆碱具有溶血等副作用[13]，故以其制备磷脂复合物时可能存在一定安全隐患，而磷脂酰胆碱是细胞膜主要成分，安全性高[14]。因此，本实验制备田蓟苷-磷脂酰胆碱复合物[15-16]，并考察其体内药动学，以期为后续相关研究奠定实验基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；MYP13-2S型磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表有限公司)；EX125DZH型电子天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司]；RE-3000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；JXDC-10型氮吹仪(拓赫机电科技上海有限公司)；XPert-3型X射线衍射仪(马尔文帕纳科公司)。

1.2 试剂与药物 田蓟苷原料药(批号191015P，纯度97.1%，成都昂赛思生物科技有限公司)；田蓟苷对照品(批号E-1170，纯度98.0%，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；磷脂酰胆碱(批号200519，纯度>98%，上海辅必成医药科技有限公司)。

2 方法

2.1 复合物制备 采用溶剂挥发法，称取40 ℃真空过夜干燥的田蓟苷100 mg和磷脂酰胆碱适量，置于圆底烧瓶中，加入50 mL四氢呋喃作为溶剂，在水浴中磁力搅拌至澄清，40 ℃真空旋蒸除去制备溶剂，即得(性状为黄色黏稠状流体)。

2.2 油制剂制备 取复合物适量，加入大豆油超声处理30 s，即得(性状为澄清透明状流体)，密封。

2.3 HPLC法测定田蓟苷含量

2.3.1 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇-0.2%磷酸(70∶30，超声混匀)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长328 nm；进样量10 μL。

2.3.2 供试品溶液制备 取复合物10 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超声溶解并定容至100 mL，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容至10 mL，混匀，即得。

2.3.3 线性关系考察 取田蓟苷对照品约20 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加入10 mL四氢呋喃溶解，甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1 mL含0.4 mg田蓟苷)，流动相稀释至10.0、5.0、1.0、0.5、0.1、0.05 μg/mL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=16.814 2X+0.397 5(r=0.999 9)，在0.05～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。

通过对交通、规划和道路现状进行分析，认为16号线上林路站设置在1号线二期车站南侧的方案一合理可行。该方案客流吸引较均匀，线路走行于规划桥桩中间，对既有高架桥影响较小。故方案一可作为推荐方案。

2.3.4 方法学考察 取复合物适量，按“2.3.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷含量RSD为1.67%，表明该方法重复性良好。取供试品溶液适量，于0、3、6、9、12、24 h在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷峰面积RSD为0.64%，表明溶液在24 h内稳定性良好。取0.05、1.0、10.0 μg/mL对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6次，测得田蓟苷峰面积RSD分别为0.52%、0.28%、0.32%，表明仪器精密度良好。称取9份复合物，每份约5 mg，置于100 mL量瓶中，每3份为1组，分别加入0.4 mg/mL对照品溶液3、4.5、6 mL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷平均加样回收率分别为99.36%、99.17%、100.82%，RSD分别为0.93%、1.14%、0.80%。

2.4 复合率测定 精密称取复合物10 mg，加入约5 mL正丁醇溶解，过0.22 μm微孔滤膜以除去未参加复合的田蓟苷，收集滤液，减压旋蒸除去正丁醇，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定参加复合的田蓟苷质量X1；另精密称取复合物10 mg，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定田蓟苷总含量X0，计算复合率，公式为复合率=(X1/X0)×100%。

2.5 Box-Behnken效应面法 在前期研究基础上，选择磷脂酰胆碱用量(X1)、水浴温度(X2)、搅拌时间(X3)作为影响因素，复合率(Y)作为评价指标，因素水平见表1。

表1 因素水平

2.6 晶型分析 采用X射线粉末衍射(XRPD)，条件为Cu-Kα靶；扫描范围(2θ)4°～43°；扫描速度8°/min。取田蓟苷、磷脂酰胆碱、物理混合物(田蓟苷+磷脂酰胆碱)、复合物适量，置于玻璃槽中，玻璃片压制平整，进行扫描。

2.7 表观溶解度测定 取过量田蓟苷、物理混合物、复合物，加入蒸馏水，超声处理15 min(底部仍可见未溶解的原料药)，25 ℃磁力搅拌48 h，取上层混悬液，8 000 r/min离心20 min，取上清液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定田蓟苷在水中的溶解度。同法测定该成分在正辛醇中的溶解度。

2.8 稳定性考察 取油制剂适量，置于温度30 ℃、相对湿度65%的恒温恒湿箱中，于0、1、3、6、9、12、18、24、30、45、60、75、90 d各取样1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，考察田蓟苷含量变化。

2.9 药动学研究

2.9.1 混悬液制备 取田蓟苷及其复合物适量，加入0.5%CMC-Na溶液，超声处理30 s，即得(田蓟苷质量浓度约为10 mg/mL)。

2.9.2 分组、给药及采血 取禁食12 h的大鼠18只，随机分为3组，每组6只，按照体质量分别灌胃给予“2.9.1”项下2种混悬液和油制剂，剂量均为50 mg/kg，于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h玻璃毛细管(肝素浸润)眼眶采血各约0.2 mL，置于肝素钠浸润过的离心管中，混匀后3 000 r/min离心2 min，取上层血浆，保存于冰箱的冷冻层中。

2.9.3 血浆处理 参考文献[6,17]报道，取100 μL血浆样品，置于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL乙腈，密封后涡旋3 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液，40 ℃氮气吹干，加入100 μL乙腈，超声处理10 s，取适量至带有内衬管的进样小瓶中待测。

2.9.4 线性关系考察 取田蓟苷对照品适量，乙腈依次稀释至3 000、1 500、500、100、50、20 ng/mL，分别取100 μL，置于1.5 mL离心管中，40 ℃氮气吹干得残渣，加入100 μL空白血浆，涡旋2 min后超声处理1 min，得3 000、1 500、500、100、50、20 ng/mL血浆对照品溶液，按“2.9.3”项下方法处理，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=1.305 6X+0.687 3(r=0.991 9)，在20～3 000 ng/mL范围内线性关系良好。

2.9.5 方法学考察 取血浆样品适量，室温下于0、3、6、9、12、24 h在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷峰面积RSD为7.13%，表明样品在24 h内稳定性良好。取20、500、3 000 ng/mL血浆对照品溶液适量，同一天内在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6次，测得田蓟苷峰面积RSD分别为4.89%、5.06%、3.17%，表明该方法日内精密度良好；同法每天测定1次，连续6 d，测得其峰面积RSD分别为9.04%、4.71%、6.94%，表明该方法日间精密度良好。取上述3种质量浓度血浆对照品溶液适量，按“2.9.3”项下方法处理，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷平均加样回收率分别为89.10%、94.44%、91.67%，RSD分别为7.01%、8.17%、6.43%。

2.9.6 数据处理与统计学分析 采用实测值计算tmax、Cmax，梯形法计算AUC。tmax组间比较采用非参数法秩和检验；Cmax、AUC经对数转换后，组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 制备工艺优化 按照表1因素水平制备复合物，中心点试验设置5组，共17组，结果见表2。

表2 试验设计与结果(n=3)

表3 方差分析

响应面分析见图1，可知当固定某一因素时，其他2个因素对复合率的影响均呈先升后降的趋势。设置复合率最大值为100%(期望值)，最小值为60.6%，得到最优工艺为磷脂胆酰碱用量176.6 mg，水浴温度49.06 ℃，搅拌时间4.59 h，复合率为99.9%，根据实际可操作性，将其修正为磷脂胆酰碱用量177 mg，水浴温度49 ℃，搅拌时间4.6 h。按上述优化工艺平行制备3份复合物，测得复合率分别为99.6%、99.9%、99.8%，平均值为99.8%，与预测值99.9%接近，表明该工艺稳定可行。另外，田蓟苷与磷脂酰胆碱比例约为1∶1。

3.2 晶型分析 图2显示，田蓟苷在10.5°、12.2°、14.3°、14.7°、24.9°等处可见其本身特征晶型峰；磷脂酰胆碱在5.5°附近可见其本身特征晶型峰；物理混合物仍可见田蓟苷、磷脂酰胆碱特征晶型峰；复合物中田蓟苷、磷脂酰胆碱特征晶型峰均完全消失，表明它是不同于物理混合物的一种物质[18-19]，以无定型状态存在。

3.3 表观溶解度测定 表4显示，复合物在水、正辛醇中的表观溶解度分别提高了10.50、16.66倍；由于磷脂酰胆碱是一种表面活性剂，故物理混合物在2种溶剂中的表观溶解度也有所提高，但程度远低于复合物。

表4 各样品表观溶解度测定结果

3.4 稳定性考察 图3显示，田蓟苷质量浓度在90 d内无明显变化，表明油制剂稳定性良好，并且无任何沉淀。

3.5 药动学研究 图4、表5显示，与原料药比较，复合物及其油制剂tmax、t1/2延长(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，以油制剂更明显(P<0.01)，口服生物利用度分别提高至2.53、5.38倍。

表5 田蓟苷主要药动学参数

4 讨论与结论

预实验对磷脂酰胆碱用量(150～200 mg)、水浴温度(25～65 ℃)、搅拌时间(2～8 h)进行了考察，在不影响磷脂酰胆碱稳定性的前提下，选择合适的制备温度及搅拌时间，并采用Box-Behnken响应面法优化处方工艺。结果，所得复合物的复合率基本接近100%。

田蓟苷-磷脂酰胆碱复合物混悬剂促进了药物吸收，可能是由于改善其溶解度所致；油制剂具有更高的生物利用度，可能是因为药物与磷脂酰胆碱之间的作用力比较弱，在水中容易重新解离，降低了促吸收作用，而制成该剂型后可使复合物免受水相等因素干扰，增加了稳定性，并且其口服后在胃肠道蠕动的作用下可能会形成微乳、自微乳、胶束等[20-21]，从而进一步促进药物吸收。另外，tmax显著延长，可能是因为油制剂对溶解于其中的药物释放具有一定阻滞作用。

综上所述，本实验所制备的田蓟苷-磷脂酰胆碱复合物与前期报道的固体分散体[6]、PLGA纳米粒[8]等剂型比较，在生物利用度提高程度方面有一定优势，并且其处方及工艺均较简单。同时，它可改善药物的脂溶性，也能为高包封率的纳米制剂研究奠定基础[22-23]。