粉防己碱纳米晶体的制备及质量评价

薛 飞， 程炳铎， 刘喜纲， 常金花， 刘 沛， 薛禾菲， 王汝兴

(承德医学院中药研究所，河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

在药物合成或研发过程中，其本身有将近50%是水难溶性，溶解性差、生物利用度低、吸收不稳定正成为主要问题[1-2]。纳米晶体由于其靶向递送作用和低毒性，在疾病诊疗中发挥着重要作用[3]，并且具有纳米尺寸和更好的溶解性，可改变药物药动学和生物分布[4-5]。

粉防己碱为异喹啉类生物碱，是传统中药防己的主要成分，具有抗炎、抗肿瘤、降压等药理作用[6-7]，目前在临床用药中以中药复方制剂为主[8]，但该成分胃肠道吸收较差，导致口服生物利用度低。因此，本实验将粉防己碱制成纳米晶体，并评价其质量，以期为相关应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器 恒温水浴锅(金坛市天竟实验仪器厂)；GT16-3高速离心机(北京时代北利离心机有限公司)；ZEN3690激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；QM3SP2行星式球磨机(南京驰顺科技发展有限公司)；LGJ-22D冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)；Nexus傅立叶红外光谱仪(美国热电尼高力公司)；DMax-2400 X射线衍射仪(日本Rigaku公司)；EQUINOX55傅里叶变换红外光谱仪(德国布鲁克光谱仪器公司)；扫描电子显微镜(日本尼康仪器公司)。

1.2 试剂与药物 粉防己碱对照品(成都普菲德生物技术有限公司，纯度99.85%)；粉防己碱原料药(西安山川生物技术有限公司)。羟丙基甲基纤维素(HPMC-E5, 北京凤礼精求医药股份有限公司)；乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(PVP-VA64, 德国BASF公司)；吐温-80(Tween-80, 天津市光复精细化工研究所)；泊洛沙姆407(P407, 北京凤礼精求医药股份有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮-K30(PVP-K30, 山东优索化工科技有限公司)；聚乙二醇-4000(PEG-4000, 北京凤礼精求医药股份有限公司)；聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus, 德国BASF公司)。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 粉防己碱含量测定

2.1.1 色谱条件 Agilent ODS C18色谱柱(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流动相乙腈-0.01 mmol/L磷酸二氢钾(含0.1%三乙胺)(80∶20)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL。

2.1.2 线性关系考察 精密称取粉防己碱对照品2.00 mg，置于10 mL量瓶中，少量甲醇超声溶解后定容，得200.00 μg/mL贮备液，甲醇依次稀释至3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL，作为对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=6.879X+0.971(R2=0.999 9)，在3.13～100.00 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取1 mL纳米晶体溶液至10 mL量瓶中，去离子水稀释至刻度，即得。

2.1.4 专属性考察 取对照品溶液、供试品溶液、空白辅料适量，甲醇稀释，摇匀，超声处理，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，三者之间无相互干扰，表明该方法专属性良好。

2.1.5 精密度试验 取4.0、50.0、80.0 μg/mL对照品溶液，同一天在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，考察日内精密度；同法连续测定3 d，每天1次，考察日间精密度，测得日内精密度RSD分别为0.29%, 0.15%、0.16%，日间精密度RSD分别为0.37%、0.48%、0.51%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 加样回收率试验 分别精密量取0.3、2.0、4.0 mL 200.0 μg/mL对照品溶液各3份，置于10 mL量瓶中，加入1.0 mL空白载体溶液，流动相定容，分别得到6.00、40.00、80.00 μg/mL溶液各3份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，粉防己碱平均加样回收率分别为101.62%、100.68%、99.37%，RSD分别为0.34%、1.68%、0.98%。

2.2 纳米晶体制备 采用湿法研磨法[9]。在50 mL烧杯中加入适量去离子水，加入不同种类稳定剂适量，搅拌分散至溶解，再加入不同比例原料药，磁力搅拌至均匀分散，得粗混悬液，加到研磨罐中，与不同规格研磨珠混合后置于球磨机中，制得纳米混悬液，精密吸取1 mL至西林瓶中，加入不同种类冻干保护剂适量，置于-80 ℃低温冰箱中预冻4 h后进行冷冻干燥，即得。

2.3 制备工艺优化 采用单因素试验。

2.3.1 稳定剂种类 按“2.2”项下方法制备纳米混悬液30 mL，共8份，考察HPMC-E5、PVP-VA64、Tween-80、P407、PVP-K30、PEG-4000、Soluplus对其粒径、PDI(将100 μL纳米混悬液用去离子水稀释400倍，采用激光粒度仪测定)的影响，结果见图2。由此可知，稳定剂为P407时，纳米混悬液粒径最小，PDI在0.2～0.3范围内；为Tween-80时，纳米混悬液粒径与为P407时相差不大，但PDI在0.6～0.8范围内，表明其分布不均匀；其他稳定剂所得纳米混悬液的粒径、PDI并不能达到理想效果。最终，选择P407作为稳定剂。

2.3.2 粉防己碱与稳定剂比例 按“2.2”项下方法制备纳米混悬液，考察粉防己碱与P407比例1∶1、3∶1、7∶1、10∶1对其粒径、PDI的影响，结果见图3。由此可知，两者比例为1∶1时，纳米混悬液粒径最小，PDI在0.2～0.3范围内。最终，选择1∶1作为粉防己碱与稳定剂比例。

2.3.3 研磨时间 按“2.2”项下方法制备纳米混悬液，考察研磨时间10、40、60、80、100、120 min对其粒径、PDI的影响，结果见图4。由此可知，随着研磨时间延长，纳米混悬液粒径、PDI逐渐下降，在120 min时两者达到最小值。最终，选择120 min作为研磨时间。

2.3.4 粉防己碱与研磨珠比例 按“2.2”项下方法制备纳米混悬液，考察粉防己碱与氧化锆珠比例1∶1、2∶3、1∶2对其粒径、PDI的影响，结果见图5。由此可知，两者比例为1∶2时，纳米混悬液粒径最小，PDI最理想。最终，选择1∶2作为粉防己碱与研磨珠比例。

2.3.5 研磨珠规格 按“2.2”项下方法制备纳米混悬液，考察研磨珠规格0.2～0.3、0.4～0.8、0.8～1.0 mm对其粒径、PDI的影响，结果见图6。由此可知，规格为0.2～0.3 mm时，纳米混悬液粒径最小，PDI最理想。最终，选择0.2～0.3 mm作为研磨珠规格。

2.4 冻干保护剂筛选

2.4.1 种类 按“2.3”项下优化工艺制备纳米混悬液若干份，每份1 mL，分别加入葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖，用量均为2.5%，振荡混匀，转移到瓶中冷冻干燥，1 mL去离子水复溶，测定其粒径、PDI，结果见图7。由此可知，甘露醇为冻干保护剂时，纳米混悬液粒径最小，PDI最理想。最终，选择甘露醇作为冻干保护剂。

2.4.2 用量 按“2.3”项下优化工艺制备纳米混悬液，考察0、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%甘露醇对其粒径、PDI的影响，结果见图8。由此可知，用量为2.5%时，纳米混悬液粒径最小，PDI最理想。最终，选择2.5%作为冻干保护剂用量。

2.5 溶出度测定 采用桨法，并设定转速为100 r/min，每批样品进行3次平行试验。精密称取原料药14.00 mg、纳米晶体100.00 mg、物理混合物(原料药+P407+甘露醇)28.82 mg，加到900 mL 37 ℃纯水(含0.2%SDS)中，于5、10、20、30、45、60 min各取样5 mL，立即补充37 ℃纯水，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算累积溶出度，绘制溶出曲线，结果见图9。

由此可知，纳米晶体溶出度从10 min开始均接近100%，即几乎全部溶出；物理混合物累积溶出度低于纳米晶体，但高于原料药；60 min内三者累积溶出度分别为94.32%，76.21%、52.09%，表明将粉防己碱制成纳米晶体后可显著改善其溶出度。

2.6 质量评价

2.6.1 平均粒径、Zeta电位测定 取纳米晶体适量，1 mL去离子水复溶，精密量取20 μL，去离子水稀释200倍，激光粒度仪测定平均粒径，结果见图10。由此可知，纳米晶体粒径为(128.22±6.25)nm，PDI为0.13±0.02，Zeta电位为(7.57±0.42)mV。

2.6.2 扫描电镜 取原料药、复溶后纳米晶体适量，在扫描电镜下观察两者形态，结果见图11。由此可知，前者形态为块状，后者形态为棒状。

2.6.3 X射线衍射

分别取空白辅料(P407、甘露醇)、原料药、物理混合物、纳米晶体约10 mg，进行X射线衍射分析，设定条件为Cu靶/石墨单色器；扫描范围3°～40°；电流30 mA；电压40 kV，结果见图12。

由此可知，原料药呈现多个尖峰，表明以晶体形式存在；空白辅料具有结晶度低于原料药的尖峰；在物理混合物对应位置也存在与原料药相同、强度较高的衍射峰；纳米晶体中粉防己碱在11.69°、17.30°处的衍射峰消失，并且其他特征衍射峰强度有不同程度的减弱，表明有一部分转变为无定形状态。

3 讨论

根据Ostwald Freundlich理论，小颗粒比大颗粒具有更高的饱和溶解度，由两者之间浓度梯度导致溶解的药物分子从小颗粒扩散后，聚集在大颗粒表面，并导致颗粒增大[10-11]，故需加入稳定剂以使药物粒子大小尽量均一[12-13]。本实验中稳定剂选择P407，其粒径、PDI均优于其他稳定剂，当粉防己碱与其比例为1∶1时，上述2种参数最理想。

介质研磨法是最常用的制备纳米晶体方法，但在研磨过程中会产生磨损，从而对纳米药物形成产生一定影响[14-15]，同时若研磨时间过短，无法使药物均匀分散，而过长又会导致纳米粒子聚集，药物稳定性降低，最终使其粒径变大[16]。本实验发现，延长研磨时间有利于纳米晶体粒径减小，但在100 min后变化不明显，故确定研磨时间为120 min。

采用冷冻干燥法固化粉防己碱纳米晶体时，可增加其稳定性，但在操作过程中易引起粒子聚集，故需加入适宜冻干保护剂以减少上述现象发生[17]。研究表明，小分子量糖与糖醇的相互作用或空间效应较强，其抗聚焦能力优于高分子糖[18-19]，故本实验选择2.5%甘露醇作为冻干保护剂。

本实验所制备的粉防己碱纳米晶体为质地疏松、色泽均匀的白色粉末，复溶后易分散，X射线衍射分析显示，部分晶型发生变化，转化为无定形状态，其原因可能是采用介质研磨法制备时晶体中分子排列的紧密程度有所下降，干扰了药物结晶状态[20]，而峰强度降低可能是由于颗粒大小减少、结晶度改变所致[21]。另外，本实验还发现药物结晶度越低，溶出速率越快，具体机制有待进一步研究。