HPLC 法同时测定决明子与其配方颗粒中2 种成分

顾英琳 张胜波 李正国

（1.济宁医学院药学院， 山东 济宁272067； 2.济宁市食品药品检验检测中心， 山东 济宁272073）

决明子为豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子［1］，始载于《神农本草经》［2］，具有清热明目、润肠通便的功效［3⁃5］。决明子配方颗粒是由具有GMP 资质的制药公司生产的中药汤剂改良产品，其优点在于携带和使用方便［6］，在临床治疗上常用于治疗羞明多泪、目暗不明、目赤涩痛、头痛眩晕、大便秘结等症状［7］，但大多数配方颗粒缺乏统一的质量标准和一致性评价［8⁃10］。配方颗粒与中药材标准水煎剂的等效性尚不清楚。研究显示，决明子中的有效成分主要为蒽醌类化合物［11⁃14］，目前有关决明子中有效成分含量测定的研究多针对橙黄决明素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素等，其中以对橙黄决明素和大黄酚的研究为主［15⁃18］。本研究拟采用HPLC 法对决明子与其配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚成分进行目标导向分离。与2020年版《中国药典》中描述的提取工艺相比，本方法操作简单、专属性高，稳定性好，更有利于企业对配方颗粒的质量进行客观评价，同时降低对决明子及其配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚含量检测的成本。

1 材料

1.1 仪器 Nexera LC⁃20ADXR 高效液相色谱系统（日本岛津公司），配置SPD⁃20A 紫外可见光检测器、LC⁃20AD多溶剂输送系统、CTO⁃20AC 柱温箱、LabSolutions 数据处理工作站；BT25S 型十万分之一电子天平、CP224S 型万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；KQ⁃500VDE 型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 大黄酚（批号110796⁃201922，纯度99.4%）、橙黄决明素（批号111900⁃202006，纯度99.0%）对照品（中国食品药品检定研究院）。决明子（批号181201，产地河南洛阳，亳州市圣海中药饮片有限公司），经专家鉴定为正品。炒决明子配方颗粒（批号9115612，2.0 g／袋，相当于原药材10 g，广东一方制药有限公司）。0.45 μm 醋酸纤维素膜过滤器（大连精研分析仪器有限公司）。甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Thermo Fisher 公司）；异丙醇为色谱纯，无水乙醇、乙酸乙酯、磷酸等均为分析纯（天津市四友精细化学品有限公司）；水为超纯水（1815 元素型摩尔超纯水系统制备）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取橙黄决明素、大黄酚对照品各10.00 mg，置于50 mL 量瓶中，加入甲醇混匀、定容，超声处理10 min，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得（质量浓度为200 μg／mL）。

2.1.2 供试品溶液 决明子粉碎后过120 目筛，精密称取粉末和配方颗粒各1 g，分别置于250 mL 圆底烧瓶中，各加入80 mL 甲醇水浴加热，回流时间为100 min，趁热过滤，用甲醇洗涤残渣3次，合并滤液，再水浴加热，回收甲醇，残渣中加入20 mL 蒸馏水进行溶解，超声处理10 min，加入20 mL 无水乙醇⁃乙酸乙酯（1∶1）混合液萃取，萃取层用水浴锅进行加热，回收溶剂，残渣用甲醇溶解，分3 次移至25 mL 量瓶中，加入甲醇混匀、定容，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 色谱条件 Waters Atlantic T3 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相90% 乙腈与10% 异丙醇混合液⁃0.1%磷酸（70∶30）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长284 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.01、0.03、0.10、0.40、2.00、5.00 mL，分别置于6个10 mL 量瓶中，甲醇稀释摇匀，定容，0.45 μm 微孔滤膜过滤，制得质量浓度 为0.2、0.6、2.0、8.0、40、100 μg／mL的对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为橙黄决明素Y＝8.41×103X＋13.26（r＝0.999 9）、大黄酚Y＝9.22×103X＋4.92（r＝0.999 8），分别在0.60～100.00 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.3.2 日内精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.6、8.0、70 μg／mL，同一天在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得橙黄决明素峰面积RSD 分别为0.67%、1.02%、1.93%，大黄酚峰面积 RSD 分别为1.32%、0.85%、1.76%，表明该方法日内精密度良好。

2.3.3 日间精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.6、8.0、70 μg／mL，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，连续3 d，测得橙黄决明素峰面积RSD 分别为0.98%、1.61%、2.60%；大黄酚峰面积RSD 分别为1.46%、1.05%、2.23%，表明该方法日间精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液及“2.1.2”项下供试品溶液适量，于0、1、2、8、12、24 h 在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得对照品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积RSD 分别为0.12%、0.21%，决明子供试品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积RSD 分别为0.34%、0.25%，决明子配方颗粒供试品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积RSD 分别为0.27%、0.24%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 称取同一批决明子和决明子配方颗粒各6份，按“2.1.2”项下方法制备决明子和决明子配方颗粒供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得决明子中橙黄决明素含量RSD 为1.26%，大黄酚含量RSD 为0.9%；决明子配方颗粒中橙黄决明素含量RSD 为0.82%，大黄酚含量RSD 为0.66%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的同一批决明子和决明子配方颗粒各6份，每份0.1 g，分别精密加入10 mL 对照品溶液（含橙黄决明素、大黄酚各10.00 μg／mL），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算加样回收率。结果，决明子中橙黄决明素、大黄酚的平均加样回收率（RSD）分别为94.20%（1.59%）、98.71%（1.01%），决明子配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚的平均加样回收率（RSD）分别为96.42%（1.50%）、102.15%（1.03%）。

2.4 含量测定 取决明子（批号181201）及其配方颗粒（批号9115612）各3份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表1。

表1 各成分含量测定结果（%，n＝3）

3 讨论

研究表明，决明子药材与配方颗粒在临床上常用于治疗羞明多泪、目暗不明、目赤涩痛、头痛眩晕、大便秘结等症状［2⁃4］。随着中药在全世界范围的推广，定量准确已经不能满足于对中药质量的控制要求，而建立多指标成分同步分析的模式已经成为关注的重点。决明子主要是通过水解蒽醌苷进行质量控制，包括其水解产物大黄酚及橙黄决明素。本研究建立测定决明子药材与配方颗粒的HPLC 特征图谱，对两者中橙黄决明素、大黄酚的含量进行测定，建立质量标准，鉴别市场上决明子药材与配方颗粒的正伪与优劣。

本研究通过对提取方式（超声提取法、热回流提取法、连续回流提取法）的考察发现，热回流提取法对橙黄决明素和大黄酚同时提取的效果相对较好；在此基础上进一步考察甲醇、70% 甲醇、50% 甲醇对提取结果的影响，结果表明甲醇提取物色谱图杂质干扰较少，且提取率较高，故选择甲醇热回流提取法；对提取时间（30、60、100、150 min）进行考察，确定提取时间为100 min时，有效成分已提取完全。此外，本研究考察不同流动相的分离效果，与传统的乙腈⁃水、甲醇⁃水、乙腈⁃0.1%磷酸这3 个不同流动相系统的分离效果相比较，乙腈与异丙醇（90∶10）混合液⁃0.1%磷酸等度洗脱对所测有效成分达到基线分离，效果较好。

相较于以往研究方法，本方法操作简单，采用等度洗脱，专属性高，稳定性好，降低检验成本，通过对决明子与配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚的含量测定，对质量进行客观评价，鉴别市场上决明子与配方颗粒的正伪与优劣，为保证药材质量提供科学依据。