UPLC⁃MS／MS 法测定右归丸中3 种双酯型生物碱及风险评价

刁春玲 邓杰华 袁秀泽 朱建蒙 杨建冬 周云峰

（1.淳安县第一人民医院， 浙江 杭州311700； 2.宜春市食品药品检验所， 江西 宜春336000）

附子是毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx.子根的加工品，具有补火助阳、回阳救逆功效［1］，临床作用显著，但毒性较强，使用不当会导致中毒甚至死亡［2⁃3］，其有效成分和有毒物质均为二萜类生物碱，其中双酯型生物碱毒性最强［4］，包括乌头碱、新乌头碱、次乌头碱［5⁃7］，故需经过炮制加工成饮片来减低毒性后才能使用，但不同方法效果有所差异［8⁃10］，不能保证完全去除该类成分，导致潜在风险一直存在。

右归丸中含有炮附片［11］，它作为附子炮制饮片可能会引入双酯型生物碱，其现行质量标准是采用TLC 法对乌头碱含量进行限制［11］，但样品前处理过程复杂繁琐，判定依据也只是与对照品比较斑点大小，专属性不强，而且部分双酯型生物碱的限量控制并不能完全消除安全风险，目前也无关于对该制剂毒性物质评价的报道。因此，本实验采用超高效液相色谱⁃串联质谱（UPLC⁃MS／MS）法同时测定右归丸中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱3 种双酯型生物碱的含量，并对其进行风险评价，以期为其他中药复方制剂安全性评价及有害物质限度控制研究提供依据。

1 材料

Waters ACQUITY UPLC H⁃class／xevo TQD 液相色谱⁃质谱联用仪（美国Waters 公司）；LE204E 电子天平（万分之一）、MS205DU 电子天平（十万之一）［梅特勒⁃托利多仪器（上海）有限公司］；PL⁃S60 超声波清洗仪（东莞康士洁超声波科技有限公司）。右归丸（小蜜丸）共12批，由仲景宛西制药股份有限公司提供。新乌头碱（批号17011302，纯度98%）、乌头碱（批号17022702，纯度98%）、次乌头碱（批号17072103，纯度98%）对照品均购于成都普菲德生物技术有限公司。甲醇、乙腈（德国默克公司）；甲酸［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相乙腈（A）⁃0.1% 甲酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.3 mL／min；柱温30 ℃；样品室温度10 ℃；进样量5 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子检测；多反应监测（MRM）模式；脱溶剂气温度600 ℃，体积流量1 000 L／h；锥孔气体积流量50 L／h，其他参数见表2。

表2 各双酯型生物碱质谱参数Tab.2 Mass spectrum parameters for various diester alkaloids

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，50% 甲醇（含0.1% 盐酸）溶解，制成含乌头碱166.600 ng／mL、次乌头碱219.520 ng／mL、新乌头碱161.500 ng／mL 的贮备液，分别精密量取1、5、10、15、25 mL，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇（含0.1%盐酸）溶解稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 供试品溶液 本品用粉碎机打碎后取约2.5 g，精密称定，置于250 mL 锥形瓶中，精密加入50%甲醇（含0.1%盐酸）50 mL，密塞，称定质量，振摇5 min，常温超声（功率250 W，频率50 kHz）处理30 min，放冷，50%甲醇（含0.1%盐酸）补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性样品溶液 取不含炮附片的本品约2.5 g 作为阴性样品，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备，即得。

2.3.4 空白溶液 不加本品，按“2.3.2”项下方法制备，即得。

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.1”项下系列质量浓度贮备液各5 μL，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，以信噪比（S／N）3∶1 时的质量浓度为检测限，结果见表3，可知各双酯型生物碱在各自范围内线性关系良好。

表3 各双酯型生物碱线性关系Tab.3 Linear relationships of various diester alkaloids

2.5 专属性试验 精密吸取对照品、供试品（批号190502）、阴性样品、空白溶液各5 μL，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液出现与对照品溶液保留时间一致的色谱峰，而且提取的各离子对均有较高响应，保留时间也基本相同，同时阴性样品、空白溶液均无对应色谱峰，对测定无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各双酯型生物碱MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of various diester alkaloids

2.6 精密度、重复性、稳定性试验

2.6.1 精密度试验 取同一份对照品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积RSD 分别为0.9%、0.4%、0.5%，表明仪器精密度良好。

2.6.2 重复性试验 取同一批本品（批号190502）6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积RSD 分别为4.5%、3.1%、3.7%，表明该方法重复性良好。

2.6.3 稳定性试验 取同一批本品（批号190502），于0、1、2、4、8、12 h 在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得乌头碱、新乌头碱、次乌头碱峰面积RSD 分别为3.4%、1.6%、2.2%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 取各双酯型生物碱含量已知的本品（批号190502）约1.25 g，精密称定，置于250 mL 锥形瓶中，精密加入对照品溶液（含乌头碱69.2 ng／mL、次乌头碱485.2 ng／mL、新乌头碱257.6 ng／mL）5 mL，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，计算回收率，结果见表4，可知均符合2020 年版《中国药典》四部［12］要求。

表4 各双酯型生物碱加样回收率试验结果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various diester alkaloids（n＝6）

2.8 样品含量测定 取12 批样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下各进样测定2次，计算含量，结果见表5。

表5 各双酯型生物碱含量测定结果（μg／g，n＝2）Tab.5 Results of content determination of various diester alkaloids（μg／g，n＝2）

2.9 风险评价 12 批样品均存在乌头碱、次乌头碱、新乌头碱3 种双酯型生物碱，具有心血管系统［13⁃14］、神经系统［15⁃16］、生殖［17⁃18］、胚胎［19］、肝肾［20］毒性，故有必要对三者风险进行评价。

2020 年版《中国药典》一部规定，炮附片含双酯型生物碱以乌头碱、次乌头碱、新乌头碱总量计，不得超过0.020%（200 μg／g），其一次服用量为3～15 g，则最大耐受总量为3 000 μg。右归丸中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱总量范围为2.346～3.241 μg／g，其一次服用量为9 g，则人体最大摄入量为29.169 μg，小于最大耐受总量，表明三者风险较小。

半数致死量（LD50）可衡量药物安全性，反映急性毒性强弱［21］，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的小鼠LD50分别为1.8、5.8、1.9 μg／g，而国际通用标准成人体质量为55.9 kg，则折算成三者引起成人急性中毒量分别为100.620、324.220、106.210 mg。服用右归丸后，进入人体的上述3 种双酯型生物碱最大总量仅为29.169 μg，即不会构成急性中毒风险。

在3 种双酯型生物碱中，乌头碱毒性最强，成人口服0.2 mg 即可中毒，3～5 mg 即可致死［22］。以0.2 mg 为口服中毒阈值，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱口服最大总量为29.169 μg，小于该阈值，表明三者产生安全风险的概率较低。

3 讨论

乌头碱、次乌头碱、新乌头碱既是有效成分，又是毒性物质，其治疗剂量与中毒剂量接近，临床治疗窗较窄［23⁃24］，易产生安全风险，故有必要对三者进行限量控制。中成药处方药味较多，成分组成复杂，如仅采用1 个离子对进行MRM 定量检测时，分子结构式类似者易产生干扰，导致假阳性，故需先对其进行定性鉴别。本实验通过一、二级质谱发现，各批次右归丸均存在与乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品相应的碎片离子，即均含有上述3 种毒性物质，再选取3 个以上响应较高者进行MRM 定量测定。

双酯型生物碱会发生水解反应，加热时其含量下降更快［25］，故对该类成分进行含量测定时需考虑上述情况。右归丸属于蜜丸，具有黏性，难以研成细粉，故本实验考察了水、0.1% 盐酸、甲醇（含0.1%盐酸）、50%甲醇（含0.1%盐酸）等溶剂，以及常温超声处理30 min、过夜浸泡、过夜浸泡后再常温超声处理30 min 等提取方法对乌头碱、次乌头碱、新乌头碱含量的影响，最终确定为50%甲醇（含0.1%盐酸）、常温超声处理30 min。

本实验建立UPLC⁃MS／MS 法同时测定右归丸中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱3 种双酯型生物碱的含量，发现市售样品中三者均较低，风险评价显示安全性较高，不易产生中毒风险。因此，有关企业在生产含附子的药品时需加强质量管理和风险把控，严格控制双酯型生物碱含量，保证原料药材和饮片质量，优化生产工艺，以期从源头上减少该类成分带来的安全风险。