基于网络药理学探讨鸡血藤治疗再生障碍性贫血的潜在作用机制

谭宏棣， 陆 亿， 万燕妮， 陆玉丹， 梁业金， 刘 鹏

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是由多种病因引起的骨髓造血功能障碍，可导致外周血全血细胞减少、骨髓造血细胞增生降低，临床上通常表现为较严重的贫血、出血和感染，常见于青壮年，在我国的发病率约为0.74/10万[1]。目前，西医治疗AA主要是通过免疫抑制和激素等方法，也取得一定的效果，但整体疗效不理想，且长期治疗容易引起消化道反应、激素水平紊乱和肝肾功能损害等[2]。越来越多的研究发现，中药治疗AA有其独特优势，可以弥补西药治疗上的不足，改善患者的生活质量[3]。鸡血藤是豆科植物密花豆(Spatholobus Suberectus Dunn)的干燥藤茎，主要分布于广东、广西、云南等地，味苦、甘，性温，归肝、肾经，具有活血补血、调经止痛、舒筋活络的功效[4]。临床上常用于保护心血管、抗肿瘤、调节酪氨酸酶、改善血液系统等[5]。也有文献报道鸡血藤在治疗AA上有一定的效果[6-7]，但其潜在的作用机制尚未明确。鉴此，本研究基于网络药理学方法，对鸡血藤治疗AA的主要活性成分及其潜在的分子作用机制进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1资料收集

1.1.1 鸡血藤活性成分筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索鸡血藤的化学成分。根据药物动力学参数[吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)、排泄(excretion)，ADME]对其可被人体吸收的活性成分进行筛选，筛选标准[8]：口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，化合物类药性(drug-likeness,DL)≥0.18。

1.1.2 鸡血藤活性成分的靶点基因获取 通过DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)对筛选出的活性成分进行靶点基因预测，剔除不能预测到作用靶点基因的成分。通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)将筛选出的靶蛋白进行蛋白基因转化，限定物种为“Homo sapiens”，得到标准化的基因名称(Gene Symbol)。

1.1.3 AA的疾病靶点基因获取 以“aplastic anemia”作为关键词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中进行检索，剔除重复的疾病基因，最终得到AA的疾病靶点基因。

1.2分析方法

1.2.1 鸡血藤活性成分靶点基因与AA的疾病靶点基因交集分析 应用在线工具Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对鸡血藤活性成分靶点基因和AA的疾病靶点基因绘制韦恩图，获得活性成分和疾病的交集靶点基因，即为鸡血藤治疗AA的关键靶点基因。

1.2.2 构建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络 将鸡血藤治疗AA的关键靶点基因输入STRING数据库的在线平台(https://string-db.org/cgi/input.pl)构建PPI网络，限定研究物种为“Homo sapiens”，最低相互作用评分设为：medium confidence>0.4，其余参数保持默认设置，获得PPI网络。

1.2.3 关键靶点基因功能注释和通路富集分析 将方法1.2.1所得的交集靶点基因通过R软件中的RSQLite程序包、BiocManage程序包、org.Hs.eg.db程序包进行处理，获得交集基因的ID。将获得的基因ID再次运用R软件中的colorspace程序包、stringi程序包、ggplot2程序包、DOSE程序包、clusterProfiler程序包、enrichplot程序包、pathview程序包进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.2.4 药物-活性成分-关键靶点基因-通路-疾病网络的构建 对方法1.2.3获得通路进行分析，从中筛选出排前10位的药物治疗疾病的相关通路，将通路、药物名称、活性成分、关键靶点基因、疾病名称导入Cytoscape3.8.2软件构建药物-活性成分-关键靶点基因-通路-疾病网络。

2 结果

2.1鸡血藤活性成分筛选结果 通过TCMSP检索得到鸡血藤的活性成分有68种，根据筛选条件共获得目标成分24种。见表1。

表1 鸡血藤活性成分筛选结果

2.2鸡血藤活性成分靶点基因获取结果 将24种目标活性成分导入DrugBank数据库中，配对得到418个靶点基因，剔除Unipro数据库检索不到的条目后共获得鸡血藤活性成分靶点基因172个，再去除重复项后，剩下56个靶点基因。

2.3AA的疾病靶点基因获取结果 经GeneCards数据库中检索，并去除重复的疾病基因后，最终得到AA的疾病靶点基因1 665个。

2.4活性成分靶点和疾病靶点交集结果 将56个成分靶点基因和1 665个疾病基因导入Venny 2.1，进行活性成分靶点和疾病靶点交集，绘制韦恩图，见图1。结果获得21个共同靶点，即为鸡血藤治疗AA的关键靶点：B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3，CASP3)、对氧磷酯酶1(paraoxonase 1，PON1)、过氧化物酶体增生激活受体γ(proliferator-activated receptor gamma，PPARG)、细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1，CHEK1)、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子(urokinase plasminogen activator，PLAU)、真核起始因子6(eukaryotic initiation factor 6，EIF6)、肿瘤蛋白p63(tumor protein p63，TP63)、蛋白激酶C(protein kinase C epsilon，PRKCE)、原癌基因蛋白(proto-oncogene，MYC)、细胞周期蛋白B1(cyclin B1，CCNB1)、v-rel网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物A(v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA)、视网膜母细胞瘤相关蛋白(retinoblastoma 1，RB1)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、MDM2癌基因(murine double minute 2，MDM2)、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)、半胱氨酸蛋白酶-7(caspase-7，CASP7)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1)、酪氨酸酶相关蛋白(tyrosinase-related protein，TYR)、谷胱甘肽S-转移酶P1(glutathione S-transferase P1，GSTP1)。

图1 鸡血藤活性成分与AA靶点交集的韦恩图

2.5鸡血藤治疗AA关键靶点的PPI网络分析结果

将21个关键靶点导入在STRING数据库，获得PPI网络。见图2。网络中涉及21个节点，73条边，平均节点数度值为6.95，平均局部聚类系数为0.651。通过比较基因相互连接次数，将连接次数较多的基因列为核心基因。列出前10的基因。见图3。

图2 鸡血藤治疗AA的PPI图

图3 核心因子柱状图(TOP10)

2.6GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果

将药物疾病共同的21个关键靶点应用R软件中的程序包进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析共获得1 052个富集结果，其中生物过程(biological processes，BP)1 012个、细胞组分(cellular components，CC)13个、分子功能(molecular functions，MF)27个。将校正值P≤0.05的项目进行排序筛选，靠前的10项分子功能气泡图。见图4。KEGG通路富集分析共得70条信号通路，将校正值P≤0.05的项目结合靶标命中数量进行排序筛选，靠前的10项通路富集分析气泡图。见图5。

图4 基因功能分析分子功能气泡图(TOP10)

图5 通路富集分析气泡图(TOP10)

2.7药物-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络构建的结果 药物-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络见图6。将网络中的57个节点根据度值(Degree)进行排序，获得鸡血藤治疗AA的主要有效成分和作用靶点，其度值前10位的有效成分和作用靶点见表2～3。

红色菱形为鸡血藤、AA和KEGG；褐色为有效成分；蓝色为关键靶点；绿色为通路

表2 鸡血藤治疗AA的主要活性成分及度值(TOP10)

表3 鸡血藤治疗AA的主要靶点及度值(TOP10)

3 讨论

3.1AA是以外周全血细胞减少和骨髓造血细胞增生低下为主要表现的获得性骨髓衰竭性疾病，在中医学属“虚劳”范畴。与国外地区相比，AA在我国的发病率相对较高[9]。目前，在西医治疗上，AA主要以免疫抑制疗法为主，可以较好地改善患者生存情况，但仍有大约30%的患者治疗无效或者复发，且长期应用免疫抑制剂和激素容易引起消化道反应、激素水平紊乱和肝肾功能损害。近年来，有越来越多的学者关注于中医药治疗AA的效果。鸡血藤是一味活血化瘀中药，主要含有黄酮类、萜类、甾醇类、木质素类及蒽醌类等化学成分，具有补血、促进造血、抗氧化、免疫调节等作用[10-11]。

3.2本研究结合网络大数据，通过网络药理学方法，筛选出鸡血藤的活性成分24种，其中木犀草素、β-谷甾醇、甘草查尔酮A、芦荟大黄素、芒柄花黄素、豆甾稀醇、8-O-甲基脲、毛蕊异黄酮对应疾病的靶点数目比较多。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫调节等作用，还具有抗凝血功能，调节血液循环[12]。β-谷甾醇是一种植物甾醇，具有抗炎、免疫调节、抗动脉粥样硬化和护肝等功能[13]，还可以通过激活PI3K/AKT信号通路上调细胞增殖能力，抑制细胞凋亡[14]。芦荟大黄素属蒽醌类物质，在保护心血管、护肝、免疫调节、抗病原微生物和抗炎等方面均具有一定的作用[15]。

3.3本研究PPI网络结果显示，CASP3、PPARG、CHEK1、RELA、Bcl-2、RB1、IL-6、MYC、MDM2、VEGFA可能是鸡血藤治疗AA的核心因子。CASP3能够特异性地剪切PARP1和Ac-DEVD-AMC，从而导致DNA裂解促进细胞凋亡，在细胞凋亡途径中成为关键的酶类之一。有报道发现在AA患者的骨髓单个核细胞中CASP3呈高表达，可能参与诱导造血细胞凋亡[16]。PPARG是重要的细胞分化转录因子，在哺乳动物的脂肪组织、血管平滑肌组织、心肌组织中均有表达，具有抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化等特性。有报道显示PPARG调控的miR-199a-5p通过抑制生长因子β诱导蛋白(transforming growth factor beta-induced，TGFBI)的表达，促进骨髓间充质干细胞成脂，这可能是AA骨髓脂肪形成的一种机制，为AA治疗提供了新的、有前景的靶点[17]。Bcl-2是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一，它具有显著抑制细胞凋亡的作用。有研究报道免疫功能紊乱与细胞凋亡密切相关，且与Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶(caspase,CASP)等被激活和表达上调有关[18]。VEGFA是分泌性血管内皮生长因子的其中一个家族成员，有研究发现，VEGFA高表达可以促进骨不连断端微小血管新生，从而带来大量的血供和营养物质；还可促进骨髓中微血管的形成，为造血细胞的成熟与分化提供有利的环境，从而促进AA患者造血功能的恢复[19-21]。IL-6是骨髓基质细胞所分泌的细胞因子，其分泌异常与AA的发生发展密切相关，参与造血细胞调控、造血功能重建，对骨髓基质细胞和免疫功能造成影响[22]。总之，这些关键蛋白，主要参与和影响细胞凋亡、免疫抑制、抗炎、抗氧化和造血功能。PPI网络图也显示，鸡血藤治疗AA是多成分、多靶点相互作用的结果。

3.4GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果显示，鸡血藤治疗AA过程中涉及多个生物过程和多个通路。BP主要涉及对氧气、类固醇激素和糖皮质激素的反应，参与信号通路的调控。疾病在发生、发展过程中是不断变化的，不同疾病在变化过程也会出现相同或相似的机理。鸡血藤治疗AA的相关通路涵盖了细胞凋亡、p53信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，还包含了与病毒、癌症、传染病等相关通路，提示不同疾病治疗通路具有相似性，为中医“异病同治”的诊疗方式提供了理论依据。有研究发现，在AA患者中发现骨髓造血干细胞、骨髓造血祖细胞大量凋亡，提示细胞凋亡是AA的重要机制之一[23]。在《血液病诊断及疗效标准》(第3版)[24]中也有说明，相关基因介导的造血干细胞过度凋亡导致的骨髓衰竭是AA的主要发病机制。而p53对AA的影响包括了核糖体生物合成、红细胞生成、癌症易感性和机体异常等方面[25]。

综上所述，本研究基于网络药理学方法，通过构建药物-活性成分-关键靶点-通路-疾病网络，揭示了鸡血藤是通过多成分、多靶点、多通路间的相互作用发挥治疗AA的作用，主要活性成分包括木犀草素、β-谷甾醇、甘草查尔酮A、芦荟大黄素、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮等，但研究结论仍需通过实验进一步验证。