杜仲叶含胶细胞的超微结构特征研究

许文秀，尚兆萌，刘佳林，王东浩，陈淑鑫，毕素素，巩秀美，刘 林，张桂芝

（临沂大学药学院，山东临沂 276005）

杜仲是国家二级保护植物，为我国特有树种，是名贵中药材和保健食料，食用杜仲有补养肝肾、强筋健骨的功效。杜仲的根、茎、叶、花、果实和种子都积累杜仲胶[1-5]。杜仲胶与天然橡胶化学组成相同，都是异戊二烯聚合物，前者是反式-聚异戊二烯，后者是顺式-聚异戊二烯[6]。作为天然高分子材料，这种反式-聚异戊二烯受到了高度重视[7]。

定量分析结果表明，成熟杜仲叶含胶量几乎达到干质量的1%，衰老叶中含量超过1%。通过石蜡制片技术所做的观察证实，积累杜仲胶的细胞（含胶细胞）仅局限于韧皮部较窄的韧皮薄壁细胞，离析法研究表明含胶细胞是细长的细胞，细胞被胶充满[1-3,5]。含胶细胞也许不只局限于韧皮部窄小细胞，但因石蜡制片技术局限性，未被胶充满的细胞观察不到，因为石蜡制片过程中，高度液泡化的细胞如叶肉细胞和表皮细胞，极易发生质壁分离，细胞质收缩成一团，从而影响对胶的观察。与石蜡制片技术相比，塑料制片技术有明显优势，细胞结构保存完整，不容易发生胞质收缩。为明确含胶细胞的分布范围，有必要采用塑料制片技术对杜仲叶含胶细胞做进一步观察。

对橡胶树细胞内橡胶的电镜观察表明，积累橡胶的细胞器是脂滴[8-9]，脂滴是一种由磷脂单分子层和蛋白质围成的小泡[10]。甘油三酯[10-13]和蜡[14]也都在脂滴中积累。因为杜仲胶与橡胶是顺反异构体，故推测杜仲胶也可能在脂滴内积累。前人用石蜡制片技术没有分辨出积累杜仲胶的脂滴（胶滴），可能与石蜡制片技术的局限性有关。

透射电镜观察表明，积累橡胶的脂滴内部电子密度相对较低，表面电子密度相对较高[9]。积累甘油三酯[10-13]和蜡[14]的脂滴，虽然形状类似，但表面电子密度比橡胶滴低。杜仲胶是橡胶的顺反异构体，积累杜仲胶的脂滴可能与积累橡胶的橡胶滴具有非常接近的超微特征。为证实杜仲胶滴是否有与橡胶滴类似的超微特征，有必要借鉴细胞内橡胶电镜观察技术对杜仲胶进行超微观察。杜仲胶是不饱和脂类，本实验基于不饱和脂类的组织化学方法，采用四氧化锇处理杜仲叶片，然后用塑料制片技术制片以观察杜仲胶，研究其含胶细胞的超微结构。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliver），种植于临沂大学教学实习与科研基地，树龄15 年。主要试剂包括戊二醛（Pella INC），四氧化锇，Epon-812（EMS），醋酸双氧铀（EMS），柠檬酸铅（EMS），甲苯胺蓝O（上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

超薄切片机，Ultracut R，Leica Instrument Shanghai Ltd；透射电子显微镜，Tecnai 12，FEI 电子光学有限公司。

1.3 方法

杜仲胶与天然橡胶是顺反异构体，前人对橡胶做过电镜观察[8-9]，本实验借鉴同样方法观察杜仲胶。取杜仲叶，切成小块，置于2%戊二醛溶液中处理12 h，再转入1%四氧化锇（Pella INC）溶液中处理4 h[15]，样品脱水后包埋于Epon-812 树脂（EMS）中。用超薄切片机切薄切片（厚度1 μm）和超薄切片（厚度60～70 nm）。薄切片不染色或用甲苯胺蓝-O 染色，于光学显微镜下观察，如果有胶滴，将会显示棕色，据此可以了解含胶细胞的分布范围，即杜仲胶在哪些组织中分布。超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅（EMS）做电子染色，于透射电子显微镜下观察胶滴。

2 结果与分析

2.1 杜仲叶片显微结构

杜仲叶片由表皮、叶肉和叶脉组成（图1）。表皮组织含有表皮细胞和保卫细胞，下表皮细胞略小。叶肉组织分化为栅栏组织和海绵组织，海绵组织厚度约为栅栏组织的2 倍。栅栏细胞呈圆柱形，长60～80μm，直径15～20 μm，排列较紧密。海绵细胞形状不规则，排列疏松，细胞间隙大。叶脉构成网状脉序，较大的叶脉由维管束与支持组织构成，支持组织位于维管束与表皮之间。支持细胞与叶肉细胞的区别主要表现在前者不含叶绿体，没有细胞间隙或细胞间隙较小。小叶脉仅含维管束，且维管束也较小。有些叶肉细胞紧密排列在维管束周围形成维管束鞘。

图1 叶片显微结构Fig.1 Microscopic structure of Ecommia leaf blade

2.2 含胶细胞

叶片内有大量含胶细胞，可按照液泡发育情况归为非液泡化含胶细胞与液泡化含胶细胞，前者不含大液泡，后者含中央大液泡。

非液泡化含胶细胞是韧皮部中那些直径较小的韧皮薄壁细胞，直径只有附近液泡化含胶薄壁细胞的1/5～1/2，光学显微镜下观察，细胞内部空间被胶填满，分辨不出胶滴轮廓（图2A、B）；透射电镜下观察，胶滴轮廓分明，彼此分离，但间距很小（约0.04 μm）（图3A、B）。细胞每张切片上可见数个胶滴，胶滴大小不等，小至0.2 μm，大到4～5 μm。

图2 韧皮部两种含胶细胞Fig.2 Microscopic structure of phloem and gutta distribution

图3 韧皮部非液泡化含胶细胞Fig.3 Non-vacuolated gutta-containing cells in the phloem

液泡化含胶细胞既包括韧皮高度液泡化的薄壁细胞（图2），也包括叶肉细胞、表皮细胞（图2、4）以及表皮与维管束之间的支持细胞（图1）。这些含胶细胞中的胶滴在光镜下即可分辨（图1、2、4），与非液泡化含胶细胞明显不同。在韧皮部液泡化的含胶细胞内，胶粒通常聚集成堆，从斜切片上较容易观察到（图2B）。在叶肉细胞中，胶滴倾向于聚集在细胞周围，特别是海绵细胞内容易观察到这一现象（图4B，5A、B）。栅栏细胞积累大量单宁（图1），胶滴显得较少，胶滴轮廓清楚（图4A）。上表皮（图4C）和下表皮（图4D）中的胶滴同样有较清楚的轮廓。保卫细胞中的胶滴形状不规则，类似变形虫（图6A、B）。

图4 液泡化含胶细胞Fig.4 Vacuolated gutta-containing cells

图5 叶肉细胞内胶滴聚集在细胞核表面Fig.5 Gutta-accumulating lipid droplets gather around the nucleus

图6 保卫细胞中的胶滴Fig.6 Gutta-accumulating lipid droplets in guard cells

2.3 胶滴的超微特征

在液泡化含胶细胞内，胶滴常常突入液泡内（图7A、B）。虽然进入液泡内，胶滴仍然被一层极薄的细胞质包围着（图7B），并且通过细胞质细丝与细胞边缘的细胞质相连（图7A）。由于有细胞质围绕着胶滴，所以看似位于液泡中的胶滴实际上没有与液泡内的液体接触。

图7 胶滴进入液泡Fig.7 Gutta-accumulating lipid droplets in the vacuole

电镜下用较高的倍数观察，各种细胞中的脂滴，除个别外，大都具有电子染色较深的表面，而内部电子染色较浅（图3、5B、7、8），特别面向小泡（见下页图8A）或液泡（图8B）的区域电子密度非常高，密布粗糙的嗜锇颗粒，但是尚不清楚产生这些颗粒的原因。

图8 胶滴特征Fig.8 Characteristic of the gutta-accumulating lipid droplets

3 讨论与结论

3.1 含胶细胞分布范围超出过去的认知

本研究首次清楚显示杜仲叶内含胶细胞包括非液泡化含胶细胞和液泡化含胶细胞，前者位于韧皮部，直径小，不含大液泡，被胶滴充满，光镜下分辨不出胶间的界限，只有在电子显微镜下才能清晰显示胶滴的轮廓；后者直径大，含中央大液泡，能产生胶滴，但不大量积累，表现为胶滴相对稀疏，或者位于细胞边缘，或者聚集于细胞核周围，或者进入液泡内部，即使在光镜下也能分辨出胶滴轮廓。非液泡化含胶细胞只是一类细胞，积累胶滴是这类细胞的主要功能；而液泡化含胶细胞不只是一类细胞，其包括韧皮部直径较大的薄壁细胞、叶肉细胞和表皮细胞，这些细胞虽然积累胶滴，但积累胶滴不是主要功能，因为叶肉细胞的主要功能是光合作用，表皮细胞的主要功能是保护。

前人用石蜡制片技术显示含胶细胞位于韧皮部，但是没有观察到叶肉细胞和表皮细胞积累杜仲胶[1-5]，这可能与石蜡制片技术的局限性有关。例如，石蜡制片过程中高度液泡化的细胞容易发生质壁分离，一旦发生质壁分离细胞质就会收缩成一团，稀疏的胶滴包裹在细胞质团里面，不容易观察到。本实验采用戊二醛和四氧化锇处理叶片组织，用塑料包埋样品，细胞结构保存完整，不发生细胞质收缩，胶滴轮廓较为清晰，所以能够在高度液泡化的叶肉细胞和表皮细胞中观察到胶滴。显然，含胶细胞分布范围之广超出了过去的认知。

3.2 胶滴与积累橡胶的脂滴超微特征相同

本研究清楚显示出胶滴的超微特征：具有电子密度相对较低的核和电子密度相对较高的表面。橡胶树积累的天然橡胶的脂滴[8-9]也具有同样的超微特征。积累甘油三酯的脂滴，如辣椒果实脂滴[11]和西瓜叶脂滴[12-13]，虽然形状类似，总体上电子密度也类似，但是它们的表面与内部的反差没有胶滴那么大，这是胶滴与积累甘油三酯的脂滴超微特征方面的细微区别。脂滴表面有膜结合蛋白[10,16-18]，膜结合蛋白与脂滴的功能和行为有关，比如脂滴间的融合就是受膜蛋白精密调控的过程[19]。膜结合蛋白使脂滴表面电子密度升高，膜结合蛋白越多，电子密度就越高。因此，胶滴的这一超微特征意味着它表面有更多的膜蛋白。

3.3 胶滴在细胞核表面聚集的意义

植物暴露于紫外辐射之中，DNA 易受紫外辐射和活性氧的伤害，紫外辐射既能直接破坏DNA 分子结构，又能诱导产生活性氧，间接破坏DNA 分子结构[20]。植物进化出多种防御紫外辐射的机制，如积累能吸收紫外辐射的酚类化合物、抗坏血酸、维生素E、类胡萝卜素、单宁等[20-21]。杜仲胶是异戊二烯的聚合物，含有大量共轭双键，具有吸收紫外辐射的特性，胶滴在细胞核表面积累，能阻止紫外辐射进入细胞核，从而保护DNA 分子免受紫外辐射损伤。

综上，本研究证明杜仲叶片内有非液泡化含胶细胞和液泡化含胶细胞，前者不含大液泡，仅为韧皮部较窄的薄壁细胞；后者含中央大液泡，包括韧皮部较大的薄壁细胞以及叶肉细胞和表皮细胞；胶滴内部电子密度相对较低，表面电子密度相对较高；叶肉细胞内尤其海绵细胞内，胶滴倾向于聚集在细胞核表面。