卷枝毛霉利用玉米秸秆水解液发酵产油脂研究

杨月萍，党文瑞，王艳霞，孙 鑫，付文清，张 靖，刘煜琦铭，孙中慧，张 瑶,2*

（1.山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东淄博 255000；2.济南大学文化和旅游学院，山东济南 250022）

随着化石资源的日益短缺和可再生能源产品需求的日益增加，产油微生物在细胞内可积累合成大量甘油三酯，因此成为生产生物柴油的重要替代原料[1-4]。此外，少数真菌、微藻、细菌等还能合成对人类健康十分有益的功能性多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸（Arachidonic acid）、γ-亚麻酸（γ-linolenic acid）、二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid）、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid）等，这些具有生物活性的脂肪酸已被认定为重要的营养食品资源[5-7]。虽然开发利用微生物合成油脂具有广阔的前景，但高成本是限制其工业化生产的主要因素。

木质纤维素是自然界中最丰富、最廉价的可再生原料之一，我国仅农作物秸秆每年产量达10 亿t，以木质纤维素为原料发酵生产微生物油脂已成为相关产业的终极目标[8-9]。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其完全水解后可得到大量可溶性单糖，主要有葡萄糖和木糖，而木糖较难被微生物利用[10-13]。此外，在木质纤维素水解处理过程中，一般还会产生乙酸、糠醛等抑制微生物生长的副产物[14-18]。因此，最佳利用木质纤维素发酵产油脂的微生物，需能代谢多种糖类，尤其是木糖，且对水解液中的副产物有一定的耐受性，这样才能高效利用木质纤维素生产脂质，如若脂质中富含人体所必须的高附加值多不饱和脂肪酸则能产生更高的经济效益。

产脂真菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）是研究脂质积累机制的模式生物，也曾用于工业化生产γ-亚麻酸[19-21]，并能够代谢木质纤维素水解液中的多种糖类（如葡萄糖、木糖等），是将木质纤维素转化为功能性脂质的理想微生物之一[22-25]。目前开拓出利用廉价原料发酵生产微生物油脂的方法成为我国未来生物柴油产业及功能性油脂发展的关键。本研究初步考察了玉米秸秆稀酸水解的条件，并研究了高产脂质菌株卷枝毛霉WJ11 在玉米秸秆水解液中发酵产油脂的特性，为实现微生物高效转化农业废弃原料生产油脂奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：卷枝毛霉WJ11（保藏编号CTCC No.M 2014424）由本实验室保藏。

玉米秸秆，购于山东犇腾农牧机械销售有限公司。

1.2 试剂及培养基

无水葡萄糖、MgSO4·7H2O、酒石酸铵、CaCl2·2H2O、KH2PO4、Na2HPO4、硫 酸 铵、FeCl3·6H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、Co(NO3)2·6H2O、MnSO4·5H2O、盐酸、甲醇硫酸、氯化钠、正己烷、十五烷酸、Ca(OH)2、氢氧化钠、异丙醇，分析纯，中国医药（集团）化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，生化试剂，北京奥博星生物技术有限公司；氯仿，分析纯，烟台远东精细化工有限公司。

种子培养基：葡萄糖30 g/L，酒石酸铵3.3 g/L，KH2PO47.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，酵母浸粉1.5 g/L，CaC12·2H2O 0.1 g/L，FeCl3·6H2O 0.008 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 g/L，CuSO4·5H2O 0.000 1 g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.000 1 g/L，MnSO4·5H2O 0.0001 g/L[25]。

发酵基础培养基：除碳源、氮源改变外，其它成分同种子培养基。

1.3 仪器与设备

电热鼓风干燥箱、恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；HABCONCO 型冷冻干燥机，照生有限公司；霉菌培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；LE-3002E/02 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Agilent 6890N 气相色谱仪，安捷伦科技有限公司；L530 型水平离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；实验室通风柜，豪迈仪器制造有限公司；ZHJH-C1115C 型超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；HWS-28 型蒸汽灭菌锅，TOMY KOGYD CO.LTD；QL-861 漩涡混合器，其林贝尔仪器制造公司；DK-8D 型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；Thermo707 型超低温冰箱，REVCO；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵，予华仪器有限责任公司。

1.4 试验及分析方法

1.4.1 卷枝毛霉的扩大培养

将卷枝毛霉孢子保存液100 μL（107CFU/mL）接种到100 mL 种子培养基中，28 ℃、130 r/min 培养24 h。根据试验方案改变培养基组成及培养条件，按一定比例接种量将上述种子液转接到包含100 mL 发酵培养基的1 L 挡板三角瓶中，28 ℃、130 r/min 培养72 h。

1.4.2 玉米秸秆稀酸水解条件优化

固定温度121 ℃、高压、固液比1∶15（g/mL）、稀硫酸体积分数2%的条件下，以水解液中还原糖含量作为衡量指标，进行玉米秸秆稀酸水解条件的单因素试验。环境压力设置为高压（0.2 MPa）、常压（0.101 3 MPa）；固液比设置为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）；水解时间设置为20、30、40、60、80 min，进行单因素试验。

1.4.3 菌株发酵条件优化

以脱毒处理后的玉米秸秆水解液作为培养基，将扩大培养24 h 的菌体作为种子液，进行单因素试验。初始pH 设置为5.0、6.0、7.0；接种量设置为5%、10%、15%、20%；葡萄糖添加量设置为2%、4%、6%；氮源种类设置为硫酸铵、蛋白胨、酵母提取物；酵母提取物浓度设置为1、2、3、4g/L。每个试验组只改变一个因素，其他条件一致。

1.4.4 玉米秸秆稀酸水解液的制备及脱毒处理

取一定质量的玉米秸秆粉末置于250 mL 的三角瓶中，用体积分数2%的稀硫酸充分水解，充分反应结束后，用真空抽滤机将玉米秸秆水解物中的上清液过滤，弃秸秆残渣。用固体Ca(OH)2粉末调节pH 至10～11 进行脱毒处理，再次过滤取滤液，弃Ca(OH)2固体粉末，用硫酸回调pH 至所需值。灭菌，无沉淀生成。

1.4.5 水解液中还原糖含量的测定

玉米秸秆稀酸水解液中还原糖含量的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS）[26]。

1.4.6 菌体生物量测定

将发酵液通过布氏漏斗进行过滤，过滤后的菌体用蒸馏水反复清洗，保存于-80 ℃冰箱中，冷冻干燥。使用前后通过差重法确定各培养物的生物量。

1.4.7 菌体油脂含量及产量与脂肪酸含量及组成测定

参考Folch 等[27]脂质提取方法。将适量冻干菌粉置于盛有2 mL HCl（4 mol/L）的水解管中充分裂解，在80 ℃条件下水浴3～5 h，每隔30 min 漩涡震荡一次。以十五烷酸（C15:0）为内标物，使用2 mL 氯仿和1 mL 甲醇对提取的脂质充分混匀15 min 进行萃取，离心分离，取下层（氯仿层）借助氮气吹干，采用差重法测定总油脂含量，加入1 mL 盐酸甲醇（10%）60 ℃下继续水浴3 h，将脂类转化为脂肪酸甲酯（FAMEs），使用2 mL 正己烷和1 mL 饱和生理盐水充分混匀后离心分离保留上层（正己烷层），借助气相色谱-质谱联用仪对合成的主要脂肪酸成分及含量进行分析。油脂含量计算公式见式（1）。

式中，m2为提取且溶剂挥发后提脂瓶的质量，g；m1为洁净提脂瓶的质量，g；m为称取的菌体质量，g。

式中，m2为提取且溶剂挥发后提脂瓶的质量，g；m1为洁净提脂瓶的质量，g；V为发酵液体积，L。

气相色谱条件：色谱柱VF-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度310 ℃；载气为高纯氮气；分流比50∶1；柱流速1 mL/min；程序升温，初始80 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至240 ℃，以10 ℃/min 升至300 ℃，保持5 min；进样量1 μL。

质谱条件：离子源EI，电离能量70 eV；离子阱温度220 ℃；传输线温度280 ℃；全扫描方式；扫描范围（m/z）50～500；检索谱库NIST05。

1.5 数据处理

实验数据以三次生物学重复试验的平均值±均值标准误差（mean±SEM）表示，采用Origin 2018 绘图并进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆稀酸水解条件的优化

2.1.1 压力对玉米秸秆水解效果的影响

秸秆预处理方法对水解液组成成分影响较大。为了减少水解液中乙酸、糠醛等抑制剂的释放，本文选择较温和的稀酸预处理方法，即采用体积分数为2%的稀硫酸对玉米秸秆进行水解。早期研究表明，玉米秸秆稀硫酸水解的最佳体积分数为2%[28]。由图1 可知，当水解时间为20、40、60 min 时，高压条件下水解的还原糖含量分别为24.4、22.5、20.8 g/L，低压条件下水解的还原糖含量分别为13.5、13.8、14.2 g/L，采用高压水解的水解液中的还原糖含量明显高于常压水解后水解液中的还原糖含量，因此，玉米秸秆稀酸水解选择高压条件。

图1 压力对玉米秸秆水解效果的影响Fig.1 The effect of pressure on the hydrolysis of corn straw

2.1.2 水解时间对玉米秸秆水解效果的影响

由图2 可知，当水解时间为20 min 时，水解液中还原糖含量最高达到24.01 g/L。而随着水解时间的延长，还原糖的含量逐渐减少，这是由于部分还原糖可能转化为其他副产物而造成含量降低。当水解时间超过60 min后，糖类被进一步分解，导致还原糖含量明显降低，甚至可能会生成更多的抑制剂，影响后续微生物对水解液的利用。因此，水解时间选择20 min。

图2 水解时间对玉米秸秆水解效果的影响Fig.2 The effect of hydrolysis time on the hydrolysis of corn straw

2.1.3 固液比对玉米秸秆水解效果的影响

由图3 可知，当固液比为1∶10 时，水解液中还原糖含量达到最大值，并且随着固液比的增大，玉米秸秆水解的还原糖含量逐渐降低。因此，本文中的玉米秸秆稀酸水解试验的固液比选择1∶10。

图3 固液比对玉米秸秆水解效果的影响Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the hydrolysis of corn straw

由以上试验结果可以看出，在无特殊装置的条件下，实验室中玉米秸秆稀酸水解的最佳条件为硫酸体积分数2%，固液比1∶10，121 ℃、高压下水解20 min。

2.2 卷枝毛霉利用玉米秸秆水解液发酵产油条件优化

2.2.1 水解液脱毒处理对卷枝毛霉发酵产油的影响

经稀酸处理的秸秆水解液一般含有如乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛等抑制物，会影响微生物的生长[18,29]。由图4 可知，在经过石灰脱毒处理后，发酵菌体的生物量、油脂含量和油脂产量均显著高于未经脱毒处理的发酵组分，说明用Ca(OH)2处理水解液能够明显减少或除去水解液中的抑制性物质，有利于促进菌体生长和脂质积累。

图4 水解液脱毒处理对卷枝毛霉发酵产油的影响Fig.4 The effect of hydrolysate detoxification treatment on the fermentation of M. circinelloides to produce lipid

2.2.2 发酵时间对卷枝毛霉发酵产油的影响

由图5 可知，发酵时间为0～60 h 时，随着发酵时间的延长，菌体的生物量、油脂含量和油脂产量均呈现先升高后降低的趋势。当发酵60 h 时，菌体生物量、油脂含量、油脂产量均达到最大值，分别为9.6 g/L、20.82%、2.0 g/L。发酵超过60 h，由于发酵液营养物质缺乏，生长环境不适合菌体生长，出现菌体自溶现象，导致生物量减少，油脂产量降低。因此，本研究选择最佳的发酵时间为60h。

图5 发酵时间对卷枝毛霉产油效果的影响Fig.5 The effect of fermentation time on the lipid production of M. circinelloides

2.2.3 初始pH 对卷枝毛霉发酵产油的影响

pH 值是影响微生物代谢和产物合成的重要因素[30]，它不仅可以影响细胞的通透性，还可以影响培养物质的离子化程度，进而对菌体吸收营养物质产生影响[31]。卷枝毛霉适合生长在微酸性环境中，且菌丝细胞的代谢会产生酸性物质，故试验设置初始pH 分别为4.0、5.0、6.0、7.0，测定菌体的生物量、油脂含量及油脂产量[32]。由图6可知，在初始pH 为4.0 时，菌株生长情况较差，所以数据未在图中显示。初始pH 为5.0 时，菌体的生物量、油脂含量及油脂产量均达到最大值，分别为10.75 g/L、21.75%和2.34 g/L；而随着pH 的逐渐上升，菌体的生物量及油脂产量会随之下降。综合考虑，卷枝毛霉发酵产油的玉米秸秆水解液培养基最适pH 值为5.0。

图6 初始pH 对卷枝毛霉发酵产油的影响Fig.6 The effect of initial pH on the fermentation of M.circinelloides to produce lipid

2.2.4 接种量对卷枝毛霉发酵产油的影响

接种量的大小决定菌体的生长繁殖速度。一般采用较大的接种量可以缩短发酵时间，使产物形成提前到来，并可减少杂菌生长的机会[33]。由图7 可知，随着接种量的增大，生物量和油脂产量逐渐提高；当接种量为15%时，菌体的生物量和油脂产量均达到最大值，分别为13.2 g/L 和2.77 g/L；但当接种量超过15%时，会因菌体生长过快，菌体间竞争性作用增强且代谢废物积累过多而影响产物的合成。综合菌株油脂总产量作为衡量指标，则最适接种量为15%。

图7 接种量对卷枝毛霉发酵产油的影响Fig.7 The influence of the inoculum amount on the fermentation of M. circinelloides to produce lipid

2.2.5 葡萄糖添加量对卷枝毛霉发酵产油的影响

碳源是培养基中最重要的组成部分，对发酵产物的形成极为关键[34]。玉米秸秆稀酸水解液中的碳源含量不足，致使菌体不能有效积累脂质，适当补充外源碳源可提高菌株的油脂积累。由图8 可知，在补加葡萄糖浓度为4%时，菌体的生物量、油脂含量和油脂产量均达到最大值，分别为13.4 g/L、32.52%和4.36 g/L。当葡萄糖浓度继续增大，其生物量、油脂含量及油脂产量均有所降低，可见高浓度的葡萄糖在一定程度上抑制了菌株的生长和脂质积累，这与前期研究结果一致[35]。因此，本研究选择的最佳葡萄糖添加量为4%。

图8 葡萄糖添加量对卷枝毛霉发酵产油的影响Fig.8 The effect of the amount of glucose added on the fermentation of M. circinelloides to produce lipid

2.2.6 氮源对卷枝毛霉发酵产油的影响

产脂真菌通常在碳源充足、其他营养成分（通常为氮源）缺乏时积累脂质，因而培养基中氮源的种类对于菌体生长和产脂特性很重要[25]。由图9 可知，当酵母提取物作为氮源时，菌体的生物量、油脂含量及油脂产量分别为13.4 g/L、32.52%、4.35768 g/L，因此本研究选择的最适氮源为酵母提取物。

图9 氮源种类对卷枝毛霉发酵产油的影响Fig.9 The effect of nitrogen sources on the fermentation of M. circinelloides to produce lipid

2.2.7 不同酵母提取物浓度对卷枝毛霉发酵产油的影响

考察不同酵母提取物浓度对卷枝毛霉发酵产油的影响，结果如图10 所示。菌体生物量随酵母提取物浓度的增加而逐渐增大；而油脂含量在酵母提取物浓度为2 g/L时达到最大值，随后随酵母提取物浓度的增大而逐渐降低，这是由于菌株在氮源受限的条件下将过量的碳源转化为脂质，氮源过多则导致脂质合成减少。综合菌株油脂总产量作为衡量指标，最适酵母提取物浓度为2 g/L。

图10 酵母提取物浓度对卷枝毛霉发酵产油的影响Fig.10 The effect of yeast extract concentration on the fermentation of M. circinelloides to produce lipid

2.3 油脂脂肪酸组分分析

经过上述条件优化后，卷枝毛霉在以Ca(OH)2脱毒处理后的玉米秸秆水解液和4%葡萄糖为基本碳源、2 g/L 酵母提取物为氮源、初始pH 5.0、接种量15%、于28℃、130 r/min 振荡发酵60 h 最终得到的生物量、油脂含量和油脂产量分别是13.4 g/L、32.52%和4.36 g/L。卷枝毛霉在最优条件下发酵玉米秸秆水解液所产油脂的脂肪酸组成分析结果见表1。气相色谱分析结果表明，不同发酵时间下卷枝毛霉WJ11 菌株所产的油脂脂肪酸组成主要为棕榈酸、油酸和硬脂酸，与植物油脂非常接近，这与前期结果一致[25]。其中，棕榈酸（C16:0）、十八烯酸（C18:1、C18:2、C18:3）等不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的70%以上，可以作为生产生物柴油的良好原料[30]。

表1 卷枝毛霉发酵所产油脂的脂肪酸组成Table 1 Fatty acid composition of the lipid produced by M. circinelloides fermentation

3 结语

本文研究了卷枝毛霉WJ11 利用玉米秸秆水解液发酵生产微生物油脂的特性。试验结果表明，玉米秸秆的最佳水解条件为稀硫酸体积分数2%、固液比1∶10（w/v）、121 ℃、高压下水解20 min。当以Ca(OH)2脱毒处理后的玉米秸秆水解液为主要原料，葡萄糖添加量为4%，酵母提取物2 g/L，接种量15%，pH 5.0，于28 ℃、130 r/min 培养60 h 时卷枝毛霉发酵产油脂效果最好，获得的生物量、油脂含量和油脂产量分别是13.4 g/L、32.52%和4.36 g/L。经气相色谱分析表明，所产油脂的脂肪酸组成与植物油脂相似，不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的70%以上，可作为生物柴油的良好原料。