FDX1在胶质瘤中的表达及其预后意义

张博弘，谢琳，欧阳乐平，何明亮*

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性神经上皮性肿瘤。目前的主要治疗手段包括：最大限度的手术切除，放疗和化疗。近半个世纪以来，对胶质瘤的研究取得了很大的进展，但关于胶质瘤发生发展的机制仍不清楚［1］。2022年3月，Tsvetkov等在《Science》上首次提出了一种全新的细胞死亡方式-“铜死亡”，这是一种铜依赖性的程序性细胞死亡方式，不同于当前的凋亡、焦亡和铁死亡，同时作者指出FDX1基因在铜死亡过程中起关键调控作用。铁氧还原蛋白1（Ferridoxin 1，FDX1）编码一种还原酶，可将Cu2+还原成毒性更强的Cu+，且与蛋白质脂酰化存在直接联系，共同促进铜死亡的发生［2］。已有的一些生物信息学分析提示FDX1具有潜在的临床价值。然而，关于FDX1在恶性胶质瘤发生发展中的具体作用未见报道。本研究将探讨FDX1在恶性胶质瘤中的表达情况及其临床预后意义。

1 材料与方法

1.1 材料

经我院医学伦理委员会批准及患者知情同意，收集神经外科2015年到2019年脑胶质瘤标本及相应的临床资料共40例，所有的患者均为初诊且术前未接受放化疗。其中男性22例，女性18例，平均年龄（49.87±5.67）岁。根据WHO分级标准，胶质瘤分为Ⅰ~Ⅳ级，其中Ⅰ级和Ⅱ级属于低级别组，共14例，Ⅲ级和Ⅳ级属于高级别组，共26例。随访至2022年05月31日。同一时期收集我科因颅脑外伤行内减压术患者的正常脑组织标本20例。

1.2 免疫组织化学法检测FDX1蛋白的表达水平

免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，按照试剂盒说明书步骤依次进行脱蜡，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，10%山羊血清封闭15 min后，加入抗FDX1一抗（兔抗人多克隆抗体，Sigma）并在4℃孵育过夜。PBS洗涤三次后，加入生物素标记的羊抗兔IgG二抗并室温孵育15 min，PBS再次洗涤后，DAB染色，苏木素复染，脱水后封片，最后在相差显微镜下观察。

1.3 免疫组化染色结果的评分

通过半定量分析对免疫组化染色的结果进行评分。阳性细胞百分比分为四层分级：0（染色缺失）、1（≤10%）、2（≤50%）和3（>50%）。染色强度分类如下：0（无染色），1（弱染色），2（中染色），3（强染色）。两个分数相乘得到染色分数（0~9分），最后分为低表达组（0~4分）和高表达组（5~9分）。

1.4 统计分析

统计分析采用SPSS 26.0统计软件。计数资料以百分比表示并采用卡方检验进行比较。Ka⁃plan⁃Meier法进行生存分析并采用Log⁃rank检验进行比较。预后的多因素分析采用Cox回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FDX1在胶质瘤组织和非肿瘤脑组织的表达

FDX1主要表达于细胞质中（图1）。在40例恶性胶质瘤样本中，高表达32例（80.0%），低表达8例（20.0%）。20例正常脑组织样本中，高表达3例（15.0%），低表达17例（85.0%）。统计分析提示胶质瘤组FDX1高表达率显著高于对照组，P<0.01。具体内容见表1。

图1 FDX1在胶质瘤组织

表1 FDX1在胶质瘤和正常对照组织中表达水平的比较［n（%）］

2.2 FDX1的表达与胶质瘤临床病理特点的关系

在32例FDX1高表达胶质瘤样本中，高级别胶质瘤24例（75.0%），显著多于低级别胶质瘤8例（25.0%），差异有统计学意义，P<0.01。然而，FDX1的表达与年龄和性别均无明显相关（P>0.05）。具体内容见表2。

表2 FDX1的表达与胶质瘤临床病理特点的关系［n（%）］

2.3 FDX1的表达水平与恶性胶质瘤患者生存预后的关系

采用Kaplan⁃Meier法对40例恶性胶质瘤患者进行生存分析，Log⁃rank检验结果显示FDX1高表达组患者的总生存率显著低于低表达组，P<0.01，风险比HR=3.18，95%CI：2.14~4.76。此外，FDX1高表达组的中位生存期为（522.90±193.50）d，而低表达组的中位生存期为（1030.20±226.80）d（图2）。

图2 FDX1高、低表达组胶质瘤患者总体生存时间比较

2.4 胶质瘤患者预后的多因素Cox回归分析

对恶性胶质瘤患者的年龄、性别、FDX1表达和WHO分级进行多因素Cox回归分析，结果显示FDX1表达和WHO分级是胶质瘤患者预后的独立危险因素（表3），FDX1高表达患者发生死亡的风险比低表达患者增加2.003倍，95%CI：1.834~2.568，P<0.01，此外，高级别胶质瘤患者发生死亡的风险比低级别患者增加2.279倍，95%CI：1.726~2.623，P<0.01。

表3 胶质瘤患者预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

2022年3月17日，Tsvetkov等在《Science》上首次提出一种具有铜依赖性、全新的细胞死亡方式⁃“铜死亡（cuproptosis）”，它是通过铜离子与线粒体呼吸中的三羧酸循环中的脂酰化成分直接结合，导致脂酰化蛋白质异常聚集和随后的铁硫簇蛋白表达下调，从而诱发蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡［2］。FDX1基因是铜死亡过程的关键调控因子［2］。因此，FDX1基因受到研究人员的广泛关注。FDX1基因编码一种小铁硫蛋白，通过铁氧还蛋白还原酶将电子从NADPH转移到线粒体细胞色素P450，参与类固醇，维生素D和胆汁酸代谢［3］。目前，基于TCGA、GTEx和GEO等公共数据库的多个泛癌生物信息学分析提示，FDX1的转录和蛋白表达水平在大多数癌症类型中显著改变，并影响某些癌症患者的预后，例如：肾透明细胞癌、头颈鳞状细胞癌、胶质瘤和肺腺癌［4-7］。然而，这些生物信息学的分析结论并未得到进一步的实验验证。因此，本研究基于我院临床样本探讨FDX1在恶性胶质瘤中的表达水平和预后意义。

研究结果表明，FDX1在神经胶质瘤样本中的表达水平显著高于在非肿瘤脑组织中的，并与病理级别呈正相关，且高表达FDX1的胶质瘤患者总体生存时间较短。然而，在肝细胞癌［8］和肺腺癌［7］中，FDX1的表达显著下调，且高表达FDX1的患者生存时间较长。这提示FDX1基因可能具有复杂的生物学功能。肿瘤免疫微环境在肿瘤的发生发展过程中起关键作用。研究报道，FDX1基因与肿瘤免疫细胞浸润相关，在大部分肿瘤中，FDX1基因与免疫细胞浸润呈正相关，而在胃癌和肾上腺皮质癌中，FDX1基因与免疫细胞浸润呈负相关，而不同的免疫细胞对肿瘤又发挥不同的作用，例如，CD8+T细胞通常与良好的预后有关，而调节性T细胞则主要与预后不佳有关［9，10，4］，因此，FDX1可能通过调控肿瘤微环境发挥不同的作用。物质代谢在肿瘤的发生发展中起关键作用，肺癌中常见葡萄糖和乳酸代谢异常［11］。研究报道，FDX1基因显著影响葡萄糖代谢，脂肪酸氧化和氨基酸代谢，在肺癌细胞敲低FDX1后，D⁃果糖6⁃磷酸水平升高，而D⁃果糖6⁃磷酸是肺癌的预后标志［7］。此外，FDX1与肿瘤化疗耐药有关，研究报道，FDX1表达与Chelerythrine，INK⁃128，Everolimus和Defac⁃tinib等药物敏感性相关。FDX1通过不同的机制可能产生截然不同的癌基因和抑癌基因的作用，需要继续深入研究予以进一步阐明。

综上所述，FDX1在恶性胶质瘤中高表达与较高的病理级别及不良预后相关，有望成为恶性胶质瘤新的治疗靶点。