基于数据库挖掘分析GPX4在前列腺癌中的表达及意义

李金，李凌峰，赖义明*

根据GLOBOCAN 2020，2020年约有240万例泌尿系统肿瘤新诊断病例，占全球所有癌症病例的12.5%。泌尿系统恶性肿瘤导致全球共有767 208人死亡（占所有癌症死亡的7.7%），在三种常见的泌尿系统肿瘤中，前列腺癌是最常见的癌症，也是全世界男性癌症相关死亡的第五大原因［1］。晚期前列腺癌需要进行内分泌治疗，但几乎所有内分泌敏感的患者在治疗1~2年后将发展为去势抵抗性前列腺癌（castration⁃resistant pros⁃tate cancer，CRPC）［2］，多西他赛化疗+泼尼松是一线治疗方法。然而癌细胞对化疗药物敏感性降低最终将导致耐药，CRPC治疗也因此成为前列腺癌研究领域的最前沿、难点热点问题之一。

化疗耐药的产生很重要的一点是由于肿瘤细胞阻遏了化疗药物所诱导的凋亡机制，从而使肿瘤细胞规避了化疗药物的杀伤作用，因此在化疗耐药引起肿瘤细胞规避正常凋亡机制的背景下，我们试图寻找新的途径，研究治疗CRPC的新方法。铁死亡（ferroptosis）是由Stockwell学者于2012年提出的一种细胞新型死亡方式，需要依赖于铁参与，并由脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS）驱动的死亡方式，区别于以前发现的细胞凋亡、坏死、坏死性凋亡［3］。细胞内脂质过氧化水平受到精细调控，而抗氧化体系的谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathion peroxidase 4，GPX4）在其中发挥关键性调节作用，但其在前列腺癌中的作用及其与前列腺癌的临床关系目前尚不明确。因此，我们选取GPX4作为本文的研究目标，通过生物信息学方法，采用挖掘公开数据库的研究方法，利用Ualcan、GEPIA2癌症数据库［4］、MethHC2.0甲基化数据库［5］、linked Omics肿瘤数据库［6］和String蛋白互作数据库［7］等综合分析了GPX4基因在前列腺癌中的表达和预后情况，分析其可能的调控机制，为进一步GPX4基因在前列腺癌中的作用提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 GPX4基因在肿瘤组织中的表达

TCGA数据库全称The Cancer Genome Atlas，主要存储各类肿瘤的表达水平以及与临床相关的数据信息，而Ualcan数据库（http：//Ualcan.path.uab.edu/）则是根据TCGA数据信息开发一个在线的研究工具网站。本研究筛选条件步骤设定为：①TCGA；②scan by gene；③enter gene symbol输入GPX4；④TCGA datasheet选择Prostate adeno⁃carcinoma。

1.2 GPX4基因与前列腺癌的临床病理分级和预后的关系

GEPIA2数 据 库（http：//gepia2.cancer.pku.cn/）GEPIA2数据库由北京大学张泽民教授团队开发，涵盖了TCGA人类肿瘤和GTEx正常组织样本这两个项目，其中覆盖33个癌种共9736个肿瘤样本、8587个正常样本的RNA⁃seq表达谱数据。本研究应用GEPIA2数据库验证之前应用Ualcan数据库所得出的相关结果。但GEPIA2数据库里并没有前列腺癌基因表达水平与病理分级关系的资料，因此本研究主要利用GEPIA2数据库探究GPX4在前列腺癌和正常组织中的表达水平差异及其与临床预后的相关性。具体步骤如下：采用Expression DIY功能，box plot分析模块，设定GPX4 mRNA差异表达的临界值：|Log2 FC|>1.5，P<0.05。预后分析包括两方面：GPX4对前列腺癌总生存期（overall survival，OS）、无病生存期（desease free survival，DFS）的影响。

为评估GPX4与前列腺癌临床分期、淋巴结转移、Gleason评分和生存预后的关系，运用linked Omics数据库进行相关的探讨分析。Linked Omics数据库功能强大，集成了来自TCGA、CPTAC等多平台38种癌症类型的多组学谱系数据和临床数据，可实现对肿瘤基因表达与临床表型、拷贝数变化、甲基化等关系［8］。通过利用Linked Omics数据库分析GPX4基因表达与前列腺癌患者临床表型及Gleason评分和生存预后的相关性。

1.3 GPX4基因的甲基化分析

MethHC 2.0是一个基于网络的综合资源，专注于人类疾病，特别是癌症的异常甲基化组，囊括了TCGA数据库在内的18种癌症相关的DNA甲基化、microRNA表达谱和基因表达谱数据，我们据此分析GPX4基因甲基化与前列腺癌的相关性。检索条件限定如下：①GENE METHYLATION；②search by：gene；③Plot Type Tumor vs Normal；④Please select cancers：PRAD Prostate Adenocarci⁃noma；⑤Select a gene region：Promoter；⑥select a methylation level evalution method：Average；⑦Gene：GPX4。

1.4 String蛋白网络分析

研究蛋白之间的相互作用网络，有助于挖掘核心的调控基因，目前已经有很多的蛋白质相互作用的数据库，而String数据库（https：//string.db.org/）绝对是其中覆盖的物种最多，相互作用信息强大的一个，该数据库可应用于2031个物种，包含960万种蛋白和1380万种蛋白质之间的相互作用。我们通过String数据库分析GPX4蛋白的相互作用蛋白，并分析其下游蛋白调控网络。本研究中输入检索条件：①Protein Name：GPX4；②Organism：homo sapiens。

2 结果

2.1 GPX4在泛癌中的差异性表达

在Ualcan数据库中共检索得到24个不同类型的恶性肿瘤统计结果（参见图1A），其中GPX4在16个肿瘤组织中显示高表达，分别是在膀胱癌、胆管癌、结肠癌、食管癌、头颈肿瘤、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状肿瘤肝癌、肺腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤黑色素瘤、甲状腺肿瘤、胃癌、子宫内膜癌等；5个临床检查结果显示其恶性肿瘤可能低表达，且主要表现集中在包括乳腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、肉瘤、胸腺瘤等。

2.2 GPX4基因在前列腺癌的表达情况

在Ualcan数据库中对描述前列腺癌的有关研究进行分析，结果显示，与正常前列腺组织相比，GPX4 mRNA水平在前列腺癌中明显高表达（P<0.001）（图1B）。通过GEPIA2数据库，分别在前列腺癌组织、正常前列腺组织以及正常人组织数据库（GTEx）中进一步验证，结果显示GPX4转录水平较正常前列腺组织表达量要明显增高（P<0.05）（图1C和图1D）。

图1 Ualcan和GEPIA2数据库中GPX4在泛癌和前列腺癌中的表达情况

2.3 GPX4基因与前列腺癌临床病理分期、Gleason评分、预后的关系

在linked Omics数据库中，我们分析了GPX4基因表达与前列腺癌的临床病理分期及淋巴结转移的相互关系，结果提示，在病理T3分期的前列腺癌组织中表达水平比T2分期高，结果具有统计学意义（P=0.0053，n=490）（图2A）。GPX4 mRNA表达水平与前列腺癌N分期（P=0.0025，n=424）（图2B）和淋巴结转移个数（P=0.0083，n=406）呈显著正相关性（图2C）。Ualcan的数据库印证了这一结论，即GPX4表达水平越高，前列腺癌淋巴结转移越多（P=0.001 6，n=424）（图2D）。另外，GPX4的mRNA表达水平也与前列腺癌Gleason评分密切相关，Ualcan的数据显示前列腺癌Gleason评分越高，GPX4表达水平也越高（P<0.05，n=496）（图2E）。

对于总生存期来说，GEPIA2数据库及linked Omics数据库结果均未提示GPX4表达升高前列腺癌总生存期越短（图2F和2G），但是GEPIA2数据库结果显示GPX4表达水平越高，前列腺癌的无病生存期（disease free survival，DFS）越低。（P=0.0095）（图2H）

图2 Linked Omics、Ualcan和GEPIA2数据库中GPX4在前列腺癌中临床病理分期、淋巴结分期、Gleason评分和预后的关系

2.4 GPX4基因甲基化水平在前列腺癌组织中的表达情况

我们检索了MethHC 2.0甲基化数据库，发现GPX4基因在前列腺癌组织中有一个转录模板NM_002085。分析结果发现，GPX4在前列腺癌组织中甲基化水平与正常组织相比明显升高（P=1.17×10⁃10）（图3）。

图3 MethHC2.0数据库中GPX4在前列腺癌与正常组织中的甲基化水平

2.5 GPX4基因主要相关蛋白网络图

通过STRING数据库分析获得GPX4相关蛋白作用网络图（图4）。GPX4主要相关蛋白分别为

图4 GPX4与上下游基因的调控网络

GRSF1、CAT、SOD2、GSR、GSS、GGGT6、CHAC1、GGT1、GGT5、GGT7。且相互作用score>0.9。将以上相关蛋白进行富集分析，发现这些基因主要参与了调节谷胱甘肽酶家族、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等糖代谢生理过程。而信号通路分析预测GPX4可能在铁死亡、谷胱甘肽代谢、花生四烯酸代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢、过氧化物酶体等途径发挥作用。

3 讨论

在欧美等发达国家，前列腺癌5年生存率已接近或超过90%，而在中国，很多前列腺癌病人发现时已进入中晚期，经手术及内分泌治疗后不可避免产生激素抵抗性前列腺癌，5年生存率仅为69.2%［8］。因此，研究诱导前列腺癌细胞死亡的新途径，探索前列腺癌的治疗新靶点，迫在眉睫，具有重要的意义。

铁死亡（ferroptosis）是一种新近发现的铁依赖性的调控性细胞死亡方式，其形态特点主要以双层膜变厚和线粒体变小为标志，同时伴以脂质过氧化为理化特征［3］。作为一种不同于细胞坏死、凋亡、坏死性凋亡和自噬的新型调控性细胞死亡方式，铁死亡在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景，特别是那些已对标准治疗方案产生耐药的肿瘤患者。目前已经在结肠癌、乳腺癌、肺癌的治疗中显示出重要的作用。铁死亡的诱导过程主要分为：耗竭谷胱甘肽、抑制GPX4和干扰铁稳态。因此，GPX4作为铁死亡脂质过氧化的重要途径，在调控铁死亡的过程中发挥着关键的作用，其主要将细胞膜上累积的脂质过氧化物还原为毒性较小的脂醇，保护细胞膜免受损伤。研究发现，GPX4在肾细胞癌和弥漫大B细胞淋巴瘤中发生的铁死亡现象起着非常敏感的调控作用［9，10］，另外某些耐药肿瘤细胞也通过GPX4抑制铁死亡来维持自己的生存［11］。因此，GPX4有望发展成为某些肿瘤治疗的新靶点。目前发现，（1S，3R）⁃RSL3是经典的铁死亡诱导剂，其能结合GPX4活性位点上的硒代半胱氨酸，引发共价作用，由此灭活GPX4。

本研究显示GPX4在16种肿瘤组织中高表达，其中包括前列腺癌组织，我们有理由相信，GPX4基因可能是前列腺癌发生发展过程中的重要角色。甲基化是影响DNA启动子表达水平的重要因素，本研究显示GPX4在前列腺癌组织中甲基化水平较正常组织明显升高，可能是造成其在前列腺癌中表达差异的重要原因。同时，高表达GPX4 mRNA的患者具有比低表达者更高的T分期、Gleason评分和淋巴结转移数。对于总生存期来说，GEPIA2数据库及linked Omics数据库结果均未提示GPX4表达升高与前列腺癌总生存期缩短相关，但是GEPIA2数据库结果显示GPX4表达水平越高，前列腺癌的无病生存期（DFS）越低。

另外，本研究还通过String数据库分析了GPX4可能参与的信号通路及相关作用蛋白，结果发现：GPX4可能在谷胱甘肽代谢、超氧化物歧化酶2、过氧化物酶体等途径发挥作用。铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，包括谷胱甘肽、磷脂、NADPH和辅酶Q10的生物合成，以及氨基酸，铁和多不饱和脂肪酸代谢等。谷胱甘肽在哺乳动物中发挥重要的抗氧化作用，是GPX4活化的首选底物，因此干扰谷胱甘肽代谢合成可阻碍GPX4对铁死亡抑制作用，使细胞发生铁死亡。另外，过氧化物酶，存在于几乎所有有氧呼吸的生物体中，用于保护细胞免受过氧化氢的毒性影响，而GPX4能降解小分子过氧化物和某些脂质过氧化物，抑制脂质过氧化。如果这些过氧化物不能有效地被GPX4淬灭，那么它们能在铁离子存在的情况下引发催化反应，最终导致细胞死亡［12］。以上结果进一步提示：GPX4可能是前列腺癌发生发展中的关键枢纽基因，其通过调控谷胱甘肽代谢和过氧化物代谢，影响着肿瘤细胞的增殖和铁死亡等生物学行为。

综上所述，GPX4在前列腺癌的发生与发展中具有重要意义，其可能作为前列腺癌的预测及治疗靶点。