肉苁蓉总苷通过调控lncRNA GAS5保护神经细胞缺血再灌注损伤

樊燕燕， 张石在

(鄂尔多斯应用技术学院医学系，内蒙古 鄂尔多斯 017000)

脑缺血是最常见的临床疾病之一，血运快速重建是脑缺血最有效治疗方法之一，然而再灌注可引起缺血区域氧化应激和炎症损伤，导致神经元凋亡，进一步加重脑损伤[1]。因此，保护神经元细胞免受缺血再灌注(I/R)损伤将为缺血性脑病治疗提供理论参考。肉苁蓉总苷是肉苁蓉中主要活性成分，具有滋补肝肾、益精血、抗氧化、抗衰老、免疫增强和神经保护作用[2]。早期研究显示，肉苁蓉总苷可减少降低脑组织梗死面积，增强抗氧化酶活性，防止脂质过氧化，减轻脑组织病理损伤，抑制脑细胞凋亡，对小鼠脑I/R具有保护作用[3-4]。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类缺乏编码能力、长度大于200 nt的RNA转录本，近年来研究证实lncRNA是大脑发育和许多神经系统疾病的重要调节剂。lncRNA生长停滞特异性转录本5(GAS5)因在雷帕霉素诱导的细胞周期阻滞中表达升高而得名，已有研究显示在缺氧诱导的神经元中lncRNAGAS5表达上调，并对细胞存活具有负调控作用[5]。抑制lncRNAGAS5表达可增加深低温停循环(DHCA)后神经元存活数量，改善大鼠DHCA后认知和记忆功能，减轻大鼠DHCA后脑损伤[6]。本研究以PC12细胞氧糖剥夺再复氧复糖模型模拟体外脑缺血再灌注损伤[7]，观察肉苁蓉总苷对缺血再灌注损伤神经细胞活力、凋亡、炎症反应的影响，并探讨其机制是否与调控lncRNAGAS5表达有关。

1 材料

1.1 细胞 大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12购自中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂与药物 肉苁蓉总苷(纯度80%，货号YN048)购自山西玉宁生物科技有限公司，实验时用含血清培养基配置所需浓度。人工脑脊液购自南京亿迅生物科技有限公司；膜联蛋白V(Annexin-V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)、兔源半胱氨酸蛋白酶3前体(pro-caspase3)、裂解的caspase3(cleaved-caspase3)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、羊抗兔IgG抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒上海广锐生物科技有限公司；SYBR-Green Master Mix、逆转录试剂盒购自宝生物工程 (大连) 有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养和模型构建 PC12细胞采用DMEM培养基(补充10%胎牛血清和1%青霉素链霉素双抗)置于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养。糖氧剥夺模型制备参考张蕾等[7]报道方法进行，选取对数生长期细胞进行实验，将DMEM培养基更换为无糖无血清的人工脑脊液模拟无氧无糖环境，置于37 ℃含95% N2、5% CO2缺氧培养箱培养4 h。

2.2 实验分组和处理 细胞分为对照组，PC12细胞不进行糖氧剥夺，仅更换为无血清DMEM培养基于正常培养箱培养24 h；I/R组，PC12细胞氧糖剥夺4 h后，更换为无血清DMEM培养基于正常培养箱培养20 h；肉苁蓉总苷低、中、高剂量组，PC12细胞氧糖剥夺4 h后，更换为含6.5、12.5、25.0 μg/mL肉苁蓉总苷[4]的无血清DMEM培养基复氧复糖20 h；si-NC组、si-GAS5组，分别转染si-NC、si-GAS5的PC12细胞氧糖剥夺4 h后，更换为无血清DMEM培养基于正常培养箱培养20 h；肉苁蓉总苷高剂量+pcDNA组、肉苁蓉总苷高剂量+pcDNA-GAS5组，转染pcDNA或pcDNA-GAS5的PC12细胞氧糖剥夺4 h后，用含25.0 μg/mL肉苁蓉总苷的无血清DMEM培养基复氧复糖20 h。细胞转染采用脂质体转染法，按照Lipofectamine 2000使用说明进行。

2.3 CCK-8法检测细胞活力 调整细胞密度至1×106/mL后接种于96孔板，每孔100 μL，贴壁后每孔加入10 μL CCK-8工作液，培养2 h后采用酶标仪在450 nm波长处读取各孔光密度(OD)值，以OD值表示细胞活力。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 预冷磷酸盐缓冲液洗涤各组细胞，1×结合缓冲液重悬后，向100 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI室温避光染色15 min，通过流式细胞仪分析细胞凋亡情况。早期凋亡(Annexin V+/PI-)和晚期凋亡(Annexin V+/PI+)之和表示细胞凋亡率。

2.5 Western blot检测pro-caspase3和cleaved-caspase3表达 用RIPA缓冲液裂解各组细胞总蛋白，检测蛋白浓度后，取等量蛋白上样至各孔进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并湿转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶封闭，特异性一抗溶液4 ℃孵育过夜，次日加二抗室温孵育2 h，使用化学发光试剂显影，采用Image J软件对目的条带灰度进行定量分析。

2.6 试剂盒检测TNF-α、IL-6水平 收集各组细胞培养液，3 000 r/min离心10 min后取上清液。按照大鼠TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒步骤加入待检样品(标准品)、检测抗体、底物，终止反应后，15 min内采用酶标仪检测各孔OD450 nm值，根据标准品绘制标准曲线，按照方程计算上清液中TNF-α、IL-6水平。

2.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNAGAS5表达 使用TRIzol试剂分别提取各组细胞总RNA，取2 μg总RNA逆转录为cDNA，按照SYBR-Green Master Mix说明书进行RT-qPCR扩增。GAS5正向引物5′-TGGTTCTGCTCCTGGTAACG-3′，反向引物5′-AGGATAACAGGTCTGCCTGC-3′；GAPDH正向引物5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGA-3′，反向引物5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′。以GAPDH作为内参，2-ΔΔCT法对lncRNAGAS5相对表达进行分析。

3 结果

3.1 肉苁蓉总苷对神经细胞缺血再灌注损伤的影响 与对照组比较，I/R组细胞活力、pro-caspase3蛋白表达降低，凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表达升高(P<0.05)；与I/R组比较，肉苁蓉总苷中、高剂量组细胞活力、pro-caspase3蛋白表达升高，凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表达降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表1、图1。

表1 肉苁蓉总苷对神经细胞缺血再灌注损伤的影响

3.2 肉苁蓉总苷对缺血再灌注损伤神经细胞炎症因子水平的影响 与对照组比较，I/R组细胞上清液中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；与I/R组比较，肉苁蓉总苷中、高剂量组细胞上清液中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表2。

3.3 肉苁蓉总苷对缺血再灌注损伤神经细胞lncRNAGAS5表达的影响 与对照组比较，I/R组细胞lncRNAGAS5表达升高(P<0.05)；与I/R组比较，肉苁蓉总苷中、高剂量组细胞lncRNAGAS5表达降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表3。

3.4 抑制GAS5表达对神经细胞缺血再灌注损伤及炎症因子水平的影响 与si-NC组比较，si-GAS5组细胞活力、pro-caspase3蛋白表达升高，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表达及细胞上清液中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，见图2、表4。

表2 肉苁蓉总苷对缺血再灌注损伤神经细胞炎症因子水平的影响

表3 肉苁蓉总苷对缺血再灌注损伤神经细胞lncRNA GAS5表达的影响

表4 抑制GAS5表达对神经细胞缺血再灌注损伤及炎症因子水平的影响

3.5 过表达GAS5逆转肉苁蓉总苷对神经细胞缺血再灌注损伤的影响 与肉苁蓉总苷高剂量+pcDNA组比较，肉苁蓉总苷高剂量+pcDNA-GAS5组细胞活力、pro-caspase3蛋白表达降低，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表达升高(P<0.05)，见表5、图3。

3.6 过表达GAS5逆转肉苁蓉总苷对缺血再灌注损伤神经细胞中炎症因子水平的影响 与肉苁蓉总苷高剂量+pcDNA组比较，肉苁蓉总苷高剂量+pcDNA-GAS5组细胞上清液中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)，见表6。

表5 过表达GAS5逆转肉苁蓉总苷对神经细胞缺血再灌注损伤的影响

表6 过表达GAS5逆转肉苁蓉总苷对缺血再灌注损伤神经细胞中炎症因子的影响

4 讨论

脑缺血损伤是世界范围内仅次于心血管疾病和癌症的常见死亡原因，研究显示，即使短暂性脑缺血也可导致海马区锥体迟发性神经元死亡，甚至诱发认知缺陷，严重影响患者生活质量[8]。因此，寻找有效的策略抑制神经细胞缺血再灌注损伤十分重要。

肉苁蓉总苷是肉苁蓉的主要活性成分，由咖啡酸、糖基和苯乙醇苷元3部分组成，具有较好的缺血再灌注保护作用。Yu等[9]研究发现，单侧注射苯乙醇苷类化合物能缩小大鼠心脏梗死面积，降低心肌组织中抗凋亡蛋白表达，并抑制心肌细胞凋亡。Wang等[10]研究发现，肉苁蓉总苷治疗能降低大脑中动脉闭塞-再灌注大鼠神经功能缺损评分和梗塞体积，促进血管生成和神经重塑，提高脑组织抗氧化活性，并有效维持血脑屏障的完整性。此外，肉苁蓉总苷亦可提高大鼠肾组织X-染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达，减少肾脏细胞凋亡，保护大鼠肾脏免受缺血再灌注损伤[11]。本研究发现，中、高剂量肉苁蓉总苷可提高细胞活力，降低缺血再灌注诱导的细胞凋亡，并呈剂量依赖性。caspase-3是内源线粒体途径和外源性死亡受体凋亡途径caspase级联反应的终极效应因子，caspase-3的激活可切割DNA，导致细胞形态特征改变，引起细胞凋亡。本研究发现，肉苁蓉总苷能降低缺血再灌注诱导神经细胞cleaved-caspase3表达，提高pro-caspase-3表达，与其抗凋亡作用一致。糖氧剥夺再复糖复氧实验除导致细胞活力降低、促凋亡因子表达和线粒体功能障碍外，严重的炎症反应对神经元细胞凋亡亦有促进作用[12]。本研究显示，肉苁蓉总苷能降低缺血再灌注诱导细胞上清液中促炎因子TNF-α和IL-6水平，与由淑萍等[13]研究相类似。以上研究表明，肉苁蓉总苷通过提高细胞活力，减轻缺血再灌注诱导的细胞凋亡和炎症反应进而对神经细胞缺血再灌注损伤具有保护作用。

lncRNAGAS5在肿瘤复发转移、心肌缺血再灌注损伤、脑卒中等病理生理过程中具有调节作用[14-15]。Wu等[16]研究显示，lncRNAGAS5过表达促进缺氧复氧暴露的心肌细胞凋亡，下调其表达可改善心肌细胞缺血再灌注损伤。Zhang等[17]研究表明，lncRNAGAS5能够增强神经元糖酵解反应，加剧缺血再灌注诱导神经元细胞凋亡，抑制lncRNAGAS5可防止脑缺血再灌注损伤，改善整体神经功能。此外，Zhao等[18]指出抑制lncRNAGAS5表达对新生儿缺氧/缺血性脑损伤具有潜在治疗作用。本研究显示，肉苁蓉总苷干预后缺血再灌注诱导的细胞中lncRNAGAS5表达降低。进一步研究显示，抑制lncRNAGAS5表达可减轻缺血再灌注诱导的细胞毒性和凋亡，降低炎症反应，与肉苁蓉总苷保护作用一致。而过表达lncRNAGAS5则逆转肉苁蓉总苷对缺血再灌注诱导的细胞活力、凋亡、炎症反应以及pro-caspase-3和cleaved-caspase3蛋白的影响，证实肉苁蓉总苷通过下调lncRNAGAS5进而对神经细胞缺血再灌注发挥保护作用。

综上所述，本研究证实肉苁蓉总苷通过下调lncRNAGAS5表达促进细胞活力，抑制细胞凋亡和炎症反应，进而对神经细胞缺血再灌注损伤发挥保护作用，这丰富了肉苁蓉总苷在神经细胞缺血再灌注损伤中的调控机制，为缺血性脑损伤治疗提供了新的方向。