陈皮油微乳处方的优化

许锦涛， 郑家勤， 王晗毓， 吴辰君， 王 浚， 董自波,2*

(1.江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 222005；2.海洋药用资源开发工程研究中心，江苏 连云港 222005)

自上世纪中后期以来，微乳技术得到了迅速发展，尤其是在中药制剂研究领域，国内研究主要集中在中药单味药或复方制剂[1]，它是由油相、水相、乳化剂和助乳化剂按一定比例混合而成的一种热力学稳定体系[2]，一般分为W/O型、O/W型、复合型，粒径在10～100 nm之间[3]。陈皮为芸香科植物橘CiteusreticulateBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾、燥湿化痰等功效，临床上用于治疗脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等[4]，其中陈皮油具有平喘、化痰、行气之功效[5]，主要成分为D-柠檬烯[6]，但因其难溶于水，性质不稳定，从而限制了应用[7]。微乳具有流动性较强、黏度较小、粒径较小等特点，故陈皮油制成该剂型后能提高生物利用度，增强稳定性，并便于储存[8]。本实验通过伪三元相图[9]得到陈皮油微乳处方，再利用星点设计-响应面法[10]优化处方，再对其外观、粒径、多分散指数[11](PDI)等指标进行评价，以期为进一步相关研究提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 KDM型调温电热套(苏州学森仪器设备有限公司)；JJ224BC型电子分析天平(上海赛多利斯贸易有限公司)；ZNCL-GS智能磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；Nano ZS激光粒度仪(英国Malvern公司)；小型台式高速离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 试剂与药物 陈皮油(自制)；吐温80(Tween-80)、蓖麻油聚氧乙烯醚35(EL-35)、PEG400(上海麦克林生化科技有限公司)；聚氧乙烯氢化蓖麻油(CO-40)(上海源叶生物科技有限公司)；甘油、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 药材 陈皮购自安徽省亳州市药材总公司中西药公司，经江苏海洋大学药学院秦昆明研究员鉴定为芸香科植物橘CiteusreticulateBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。

2 方法与结果

2.1 水蒸气蒸馏提取工艺优化

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 料液比 称取50 g陈皮，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入10倍量水浸泡过夜，发现吸收较完全，再分别以料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14提取4 h，结果见表1，选择1∶8、1∶10、1∶12进行后续考察。根据2020年版《中国药典》方法测定陈皮油提取率，公式为提取率=(陈皮油质量/陈皮质量)×100%。

2.1.1.2 浸泡时间 固定料液比1∶10，提取时间6 h，分别浸泡0.5、1、1.5、2、2.5 h，结果见表1，选择1、1.5、2 h进行后续考察。

2.1.1.3 提取时间 固定料液比1∶10，浸泡时间1 h，连续提取7 h，结果见表1，可知随着提取时间延长陈皮油提取率先快速增加后趋缓，故选择4、5、6 h进行后续考察。

表1 单因素试验结果

2.1.2 正交试验 在单因素试验基础上，按L9(34)表进行正交试验[12]，因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4。由此可知，各因素影响程度依次为提取时间(C)>料液比(A)>浸泡时间(B)，最优工艺为A2B1C3，即料液比1∶10，浸泡时间1 h，提取时间6 h。

表2 正交试验因素水平

表3 正交试验设计与结果

表4 正交试验方差分析

2.2 伪三元相图

2.2.1 乳化剂、助乳化剂用量筛选 分别选择EL-35、CO-40、Tween-80作为乳化剂，PEG400、甘油、无水乙醇作为助乳化剂。先固定Km值(乳化剂用量与助乳化剂用量的比值)为1，向50 mL干净干燥烧杯中分别按油相与混合乳化剂比例10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10依次加入乳化剂、助乳化剂、陈皮油，在500 r/min、(37±2)℃条件下进行磁力搅拌，待初乳液混匀后缓慢滴加纯化水，使溶液由澄清变浑浊再变澄清，或由浑浊变澄清，当澄清至不再变化时记录临界点加水量[13]，通过马尔文激光粒度仪进行测定，以确定粒径是否符合要求。再将油相、水相、混合乳化剂分别作为3个顶点绘制伪三元相图，见图1。

2.2.2Km值确定 由图1可知，以EL-35为乳化剂，甘油为助乳化剂，在Km值为1时微乳区域最大。Km值分别取1/3、1/2、2/3、1、3/2、2、3，油相与Ts比例分别取10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10，依次加入烧杯后在500 r/min、(37±2)℃条件下制备微乳，通过绘制伪三元相图比较微乳区域大小，见图2。由此可知，以EL-35为乳化剂，甘油为助乳化剂，Km值为1/2时，微乳面积最大。

2.3 星点设计-响应面法 由“2.2”项下结果可知，随着含油量、Km值变化，微乳区域大小也有所改变，其中Km<1/2或>2时无法形成微乳或存在大量的凝胶区而影响其形成，同时含油量>70%时也较难形成微乳。因此，在文献[14]报道与单因素试验基础上，本实验确定了以含油量、Km值为影响因素，粒径、PDI为评价指标，星点设计-响应面法优化处方，因素水平见表5，结果见表6。由此确定，含油量为10%～60%，Km值为0.5～2。

表5 星点设计-响应面法因素水平

表6 星点设计-响应面法设计与结果

按“2.2.1”项下方法制备微乳，通过Design-Expert8.0软件进行方差分析，见表7～8。由此可知，模型具有高度显著性(P<0.01)，失拟项P>0.05，AB、A2、B2对粒径和PDI的影响较显著(P<0.05)。

表7 粒径方差分析

表8 PDI方差分析

2.4 验证试验 根据优化处方进行3次验证试验，结果见表9，可知粒径、PDI平均值分别为14.70 nm、0.070，与理论值14.63 nm、0.067接近(相对偏差分别为0.5%、4.3%)，表明工艺稳定可靠。

3 微乳理化性质检查

3.1 外观性状 微乳澄清透明，呈略显微弱的淡蓝色，再分别滴加亚甲蓝溶液、苏丹Ⅲ溶液，发现前者较快扩散到微乳体系中，而后者一直停留在表面，表明它为O/W型，见图4。

3.2 形态 将微乳滴在覆有支持膜的铜网上，静置20 min后滤纸片吸干，再滴加2%磷钨酸溶液，置于铜网上负染10 min，待自然挥干后在透射电子显微镜下观察，见图5。

3.3 稳定性 将微乳在5 000 r/min下离心30 min，发现离心前后未见分层，表明其稳定性良好。

4 讨论

本实验采用最常用的水蒸气蒸馏法提取陈皮油，最佳提取条件为料液比1∶10，浸泡时间1 h，提取时间6 h，因药材未粉碎，故提取率略低于先前文献[15]报道。微乳制备方法较简单，常用高压均质法[16]、加油滴定法和加水滴定法等，其中加水滴定法最常见，在处方合理的情况下均能形成，与各组分的加入顺序无关，具有吸收快、靶向释放、增加溶解度等特点[17]。判断溶液是否为微乳的最有效直接办法就是测定粒径和PDI，在一定范围内，粒径越小表示微乳体系越稳定，PDI越小则表明微乳中颗粒分散越均匀，因此，在筛选陈皮油微乳处方时，以两者和PDI为指标能得到最佳处方组成。星点设计-响应面法是一种采用非线性数学模型拟合进行二阶实验设计的方法，相比较均匀设计法具有实验次数少、精密度高、预测性好等特点[18]。本研究采用加水滴定法制备陈皮油微乳，在伪三元相图筛选最佳处方的基础上，经星点设计-响应面法对处方组成进行优化，验证试验表明其重复性良好，方法可行。综上所述，本研究制备了澄清透明、分布均匀显微弱淡蓝色的陈皮油微乳，其粒径较小，分散均匀，稳定性更好，为进一步扩大陈皮油的应用奠定了基础。