止血明目方对糖尿病视网膜病变大鼠炎症因子和氧化应激的影响

贾鑫，刘英琳，杨赞章，张丹，李明然，张铭连

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是眼科最常见的糖尿病并发症，是中老年人视力障碍的主要原因之一[1-2]。DR 发病机制复杂，目前认为其与炎症、氧化应激等多因素有关[3]。研究[4-5]表明，糖尿病患者的高血糖状态导致炎症因子、氧化应激产物产生过多，损伤血-视网膜屏障形成渗漏；随着病程进展，缺氧刺激促炎、促血管生成因子过度表达，进一步诱导视网膜新生血管生成，最终导致患者视力降低、甚至失明。张铭连教授在多年中医眼科疾病临床诊疗实践中，基于络病理论创立了止血明目方（ZXMM），用于治疗DR取得了较好的临床效果。本研究以ZXMM 干预实验性DR 大鼠，观察大鼠视网膜病理改变情况，检测血清及视网膜中炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、可溶性细胞间黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）、抗氧化酶类超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血管内皮生长因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）水平，探讨其治疗DR 的作用机制，为该方的临床应用及中医药防治DR的研究工作提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠40 只（80 只眼），体重（220±20）g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2021-0006。饲养于河北省眼科医院实验动物室，环境温度22℃～24℃，相对湿度50%～60%，明暗交替，自由摄食饮水。本研究实验动物及实验所用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定。

1.2 试剂、仪器与药物

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma 公司，S0130），0.1 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）、苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，C1013、G1121），羟苯磺酸钙（calcium dobesilate，CD）胶囊（宁夏康亚药业股份有限公司，H20110031），IL-6、sICAM-1、SOD、VEGF-A 酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，ml102828V、ml003031V、ml059387 V、ml630359V）。

血糖测量仪及试纸（美国Johnson 公司，OneTouch Verio），倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司，CKX41），酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司，RT-6100），低温高速离心机（上海安亭科学仪器厂，TGL-16gR），超低温冰箱（美国Thermo公司，Thermo902）。

ZXMM 药物由墨旱莲、丹参、郁金、蒲黄、赤芍、牡丹皮、荆芥、夏枯草、川芎、三七、茜草炭组成，由河北省眼科医院中药房提供，药材购自安国市盛方中药饮片有限公司。经水煎，浓缩为含生药3.06 g/mL和4.59 g/mL的低、高剂量药液。

1.3 DR模型的建立

40 只SD 大鼠适应性喂养7 d 后，随机分为正常组8 只（control group，CG）和DR 模型组32 只（model group，MG），采用单次腹腔注射STZ的方法建立糖尿病模型。禁食禁水8 h，STZ溶于0.1 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5），MG 大鼠腹腔注射1% STZ（45 mg/kg），CG 大鼠腹腔注射等体积柠檬酸钠缓冲液，注射后30 min 内恢复自由摄食饮水。STZ 注射72 h 后，经尾静脉采血使用血糖测量仪和血糖试纸测定大鼠空腹血糖，选取血糖值≥16.7 mmol/L 者为糖尿病模型大鼠[6]，32只大鼠均造模成功。继续饲养14 d后，对糖尿病大鼠进行荧光素眼底血管造影检查，根据临床诊断标准选取发生视网膜病变的大鼠作为DR模型大鼠，共26只。

1.4 分组与给药

选取24 只DR 大鼠随机分组为MG、CD、ZXMM低剂量组（LZXMM）和ZXMM 高剂量组（HZXMM），另设正常大鼠为CG，每组6 只。LZXMM 和HZXMM 分别予浓度3.06 g/mL、4.59 g/mL 的ZXMM药液10 mL/kg（30.6 g/kg、45.9 g/kg）灌胃，CD 给予羟苯磺酸钙胶囊水溶剂0.135 g/kg 灌胃，CG 和MG 给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续灌胃30 d。

1.5 体重及血糖测定

给药0 d、15 d、30 d 后，分别测量各组大鼠的体重，采用尾静脉取血法经血糖仪测定各组大鼠的血糖值。

1.6 样本采集与处理

各组大鼠腹腔麻醉后迅速摘除双侧眼球，用预冷磷酸盐缓冲液冲洗去除残留血液。摘除的一侧眼球置于4%多聚甲醛溶液中，室温固定待检；同一只大鼠的另一侧眼球置于显微镜下剥离视网膜组织，称重后加入适量磷酸盐缓冲液，低温裂解组织，使用低温离心机5,000 ×g 离心15 min，取上清液保存于-80℃冰箱内待检。同时，摘除眼球的大鼠经眶静脉采血，将收集于血清分离管的全血标本室温放置30 min，使用低温离心机1,500×g 离心15 min，取血清保存于-80 ℃冰箱内待检。

1.7 HE染色

固定于4%多聚甲醛溶液的大鼠眼球常规石蜡包埋后切片，经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水洗，按照HE 染色试剂盒操作说明，依次进行苏木素染液染色、分化液分化、返蓝液返蓝和伊红染色，之后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，置于光学显微镜下观察、拍照。

1.8 血清与视网膜中相关因子的测定

血清与视网膜组织中IL-6、sICAM-1含量、SOD活性及VEGF-A 水平均采用ELISA 法测定，使用酶标仪于波长450 nm 处测量各样本的吸光度值，计算样本的浓度。操作方法按照ELISA 试剂盒说明书进行。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用独立样本t检验，当P＜0.05时被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重及血糖情况

CG 大鼠在饲养过程中，体重随着周龄增大而逐渐增加，血糖均在正常范围内。5 组间大鼠体重和血糖值比较，给药0 d 时差异均无统计学意义（均P＞0.05），给药15 d 和30 d 时，差异均有统计学意义（体重：F15d=11.208，F30d=12.987；血糖：F15d=112.488，F30d=502.665，均P=0.000）。在给药15 d和30 d 时，与CG 比较，MG、CD、LZXMM 和HZXMM 大鼠体重均显著减轻（15 d：tMG=4.270，P=0.002；tCD=6.045，P=0.000；tLZXMM=5.012，P=0.001；tHZXMM=7.344，P=0.000。30 d：tMG=4.621，P=0.001；tCD=7.465，P=0.000；tLZXMM=5.338，P=0.000；tHZXMM=7.712，P=0.000），血糖值均显著升高（15 d：tMG=-18.996，tCD=-13.154，tLZXMM=-34.015，tHZXMM=-56.657，均P=0.000；30 d：tMG=-52.809，tCD=-34.659，tLZXMM=-39.717，tHZXMM=-49.120，均P=0.000）。结果表明，糖尿病大鼠模型建立成功，持续保持高血糖水平，而ZXMM 不影响糖尿病大鼠体重及血糖水平（表1）。

表1 各组大鼠体重及血糖变化（，n=6）

表1 各组大鼠体重及血糖变化（，n=6）

注：*与CG比较，P＜0.05；CG 正常对照组；MG 模型组；CD 羟苯磺酸钙组；LZXMM 止血明目方低剂量组；HZXMM 止血明目方高剂量组

2.2 ZXMM对DR大鼠视网膜形态的影响

CG大鼠视网膜各层结构清晰，细胞排列均匀致密，形态无异常改变（图1A）；与CG比较，MG大鼠视网膜变薄，细胞排列松散不规则，神经节细胞层出现空泡样改变（图1B）。与MG比较，CD大鼠视网膜厚度增加，各层细胞排列致密（图1C）；LZXMM 和HZXMM 大鼠视网膜厚度增加，细胞排列基本规则，神经节细胞数量增多，表明ZXMM 对视网膜组织具有保护作用（图1D、图1E）。

图1 止血明目方对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜形态的影响（HE染色，×40）

2.3 ZXMM 对DR 大鼠血清和视网膜IL-6、sICAM-1、SOD、VEGF-A水平的影响

5组间大鼠血清和视网膜IL-6、sICAM-1、SOD、VEGF-A 水平比较，差异均有统计学意义（血清：FIL-6=21.828，FsICAM-1=21.713，FVEGF-A=19.092，FSOD=17.956，均P=0.000；视网膜：FIL-6=24.227，FsICAM-1=83.921，FVEGF-A=59.096，FSOD=37.982，均P=0.000）。

两两比较，①IL-6：与CG 比较，MG 大鼠血清和视网膜IL-6 水平升高（血清：t=-8.090，视网膜：t=-8.946，均P=0.000）；与MG 比较，CD、LZXMM 和HZXMM 大鼠血清和视网膜IL-6水平降低（血清：tCD=6.445，tLZXMM=5.237，tHZXMM=7.190，均P=0.000。视网膜：tCD=6.067，P=0.000；tLZXMM=3.907，P=0.003；tHZXMM=8.004，P=0.000），差异均有统计学意义。②sICAM-1：与CG 比较，MG 大鼠血清和视网膜sICAM-1 水平升高（血清：t=-13.221，视网膜：t=-18.487，均P=0.000）；与MG 比较，CD、LZXMM 和HZXMM 大鼠血清和视网膜sICAM-1 水平降低（血清：tCD=6.584，P=0.000；tLZXMM=4.301，P=0.002，tHZXMM=5.891，P=0.000。视网膜：tCD=7.522，tLZXMM=12.737，tHZXMM=14.507，均P=0.000），差异均有统计学意义。③VEGF-A：与CG比较，MG 大鼠血清和视网膜VEGF-A 水平升高（血清：t=-7.135，视网膜：t=-20.695，均P=0.000）；与MG比较，CD 和HZXMM 大鼠血清和视网膜、LZXMM 大鼠视网膜VEGF-A 水平降低（血清：tCD=6.734，P=0.000；tHZXMM=4.243，P=0.002。视网膜：tCD=7.208，tLZXMM=5.620，tHZXMM=13.648，均P=0.000），差异均有统计学意义。④SOD：与CG 比较，MG 大鼠血清和视网膜SOD 水平降低（血清：t=7.442，视网膜：t=10.718，均P=0.000）；与MG 比较，CD、LZXMM 和HZXMM 大鼠血清和视网膜SOD 水平升高（血清：tCD=-3.193，P=0.010；tLZXMM=-2.346，P=0.041；tHZMXX=-5.021，P=0.001。视网膜：tCD=-7.919，tLZXMM=-8.314，tHZMXX=-10.054，均P=0.000），差异均有统计学意义（表2）。

表2 ZXMM对DR大鼠血清及视网膜IL-6、sICAM-1、VEGF-A、SOD水平的影响（，n=6）

表2 ZXMM对DR大鼠血清及视网膜IL-6、sICAM-1、VEGF-A、SOD水平的影响（，n=6）

注：*与CG 比较，P＜0.05；#与MG 比较，P＜0.05。IL-6 白细胞介素-6；sICAM-1 可溶性细胞间黏附分子-1；VEGF-A 血管内皮生长因子-A；SOD 超氧化物歧化酶；CG 正常对照组；MG 模型组；CD 羟苯磺酸钙组；LZXMM 止血明目方低剂量组；HZXMM 止血明目方高剂量组

3 讨论

目前DR 的发病机制尚未完全明确，有观点认为炎症因子的释放和白细胞对毛细血管的异常黏附聚集是其发展的初始事件[7]。IL-6 是一种强效促炎因子，在机体炎性级联反应中发挥核心作用。sICAM-1 是细胞黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的循环形式，可增加白细胞在毛细血管内的黏附聚积。在高血糖状态下，IL-6、sICAM-1 等炎症因子大量释放，引起血管内皮细胞损伤、炎性细胞活化聚集等，进一步诱导视网膜病理性新生血管形成[3]。VEGF 是一类特异性作用于内皮细胞的调控因子，其中VEGF-A 被认为是引起血管渗漏及新生血管形成的关键介质[8]。研究[9-10]证实，DR 患者血清IL-6、sICAM-1、VEGF 高表达，且其水平与视网膜病变程度呈正相关。氧化应激是DR 的又一个主要致病因素。高血糖状态亦加剧了机体氧化应激程度，抗氧化防御系统功能降低，从而引起视网膜组织损伤[11]。SOD 是主要的内源性抗氧化酶家族，其活性反映了机体与组织的抗氧化应激能力[12]。

中医药在防治DR 早期发展的关键环节具有突出优势[13]。张铭连教授基于中医络病理论和中医眼科专家庞赞襄“目病多郁论”学术思想提出了“目络理论”，并以此为指导结合多年临床诊疗经验创立了ZXMM，可有效改善DR 患者眼部微循环，显著促进视网膜和玻璃体内出血吸收，改善患者视力[14]。DR 中医病机概括为“肾虚是根、阴虚为本、血瘀为标”[15]，治疗当以凉血止血、滋补肝肾、活血化瘀为基本法则[16-17]。ZXMM 以墨旱莲、三七为主药进行组方，墨旱莲滋补肝肾、凉血止血，三七止血散瘀；辅以丹参疏通血脉，郁金、川芎行气解瘀，赤芍清热凉血，蒲黄、牡丹皮、荆芥等止血化瘀；佐以夏枯草、茜草炭平肝解郁，共奏滋阴止血、散瘀宁络之功效，符合DR 疾病治疗的法则。羟苯磺酸钙作为一种血管保护药物，临床用于治疗DR 或糖尿病肾病[18-19]。研究[20-21]表明，该药可降低糖尿病大鼠炎症因子、氧化应激指标水平，抑制视网膜血管白细胞黏附及VEGF 过表达，常作为糖尿病微血管并发症治疗药物研究的阳性对照药[22]。

本研究采用STZ 诱导DR 大鼠，发现与CG 相比，MG 大鼠血糖水平显著升高，视网膜组织病理损伤明显，血清及视网膜组织中抗氧化酶类SOD 活性显著下降，炎症因子IL-6、sICAM-1 及血管生长调控因子VEGF-A 水平均显著升高。因此，严重的炎症和氧化应激反应可能是实验性糖尿病大鼠发生视网膜病变的重要因素。药物干预后，CD、LZXMM、HZXMM 大鼠视网膜病理损伤表现有所改善，血清及视网膜中SOD 活性较MG 升高，IL-6、sICAM-1 及VEGF-A 水平较MG 均降低，且HZXMM的调节作用优于LZXMM，提示ZXMM 能减少DR 大鼠体内及视网膜组织炎症因子含量并增强其抗氧化应激能力，缓解了炎症及氧化应激反应诱导的视网膜损伤。此外，本研究证实IL-6、sICAM-1、VEGF-A 水平在糖尿病大鼠血清和视网膜中均升高，且ZXMM 治疗后其水平均降低，提示血清和视网膜中同一炎症因子变化的相关性[23-24]。

综上所述，ZXMM 能降低DR 大鼠血清和视网膜IL-6、sICAM-1、VEGF-A 水平，提高SOD 活性，抑制炎症反应并减轻氧化应激损伤，有效改善糖尿病引起的视网膜病理损伤。本研究初步探究了ZXMM的作用机制，为该方的临床应用以及中医药防治视网膜新生血管性疾病研究提供了实验证据。