猕猴桃溃疡病检测技术研究进展概述

王燕平，易春燕，张翠翠，陈庆东，涂美艳

(1.四川省农业科学院植物保护研究所/农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，成都 610066； 2.四川省农业科学院园艺研究所/农业农村部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，成都 610066)

猕猴桃是一种雌雄异株的多年生大型落叶藤本浆果，具有很高的营养和药用价值，富含丰富的VC，被称为“果中之王”。近年来，各地区猕猴桃患病的报道越来越多，尤其是猕猴桃溃疡病。猕猴桃细菌性溃疡病是世界范围内的重大植物病害之一，主要是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(PSA)引起[1]，该病菌是中国、美国、新西兰和欧洲植物保护组织(EPPO)的植物检疫对象，具有传播速度快、致病性强、发病部位多、防治困难等特点。

猕猴桃溃疡病是目前无法根治的一种病害，以预防为主，一旦整株患病至末期只能进行销毁。近年猕猴桃苗木频繁引种，检疫把关不严，导致猕猴桃溃疡病在各地陆续发生[2]，该病在全国范围内已报道的猕猴桃主产区都造成了严重的危害，感染Psa日趋严重，影响果实品质和商品性，因此Psa的早期诊断、早期预防是预防大面积爆发猕猴桃溃疡病的前提。随着分子生物学技术的发展，猕猴桃溃疡病的检测主要是基于PCR原理，而常规的PCR技术并不能准确区分检测样中病原菌的生存状态，导致检测出假阳性的结果，因而急需建立有效的检测手段来鉴别Psa。本文阐述近年所采取的猕猴桃溃疡病检测技术，以期为猕猴桃溃疡病的快速检测和防控研究提供参考。

1 猕猴桃溃疡病概况

1.1 病原菌的生物学特性

Psa为好氧菌，短杆状或稍有弯曲的两端钝圆的革兰氏阴性细菌，多数具有1根鞭毛，少数有2～3根鞭毛，不产芽孢，无荚膜。在牛肉膏培养基上菌落为乳白色、圆形、边缘光滑，生长缓慢；该菌喜好低温、高湿及强光照；能在含有蔗糖的培养基上产生果聚糖，菌落呈现粘液状。病菌对高温适应性差，15～25℃是最适宜生长温度。

1.2 分布与危害

猕猴溃疡病是一种严重为害猕猴桃产业发展的毁灭性病害，该病于1980年在日本和美国首次发现，此后相继在中国、意大利、新西兰等国发生。近年来，在我国的陕西、四川、贵州、湖南、江苏和浙江等16个省份发生流行、危害，猕猴桃主产区频繁流行，发病普遍严重，严重地阻碍了我国猕猴桃产业的发展。

1.3 危害症状

病菌主要危害猕猴桃的主干、枝蔓、嫩梢、叶片及花蕾等部位，造成枝条枯死、整株死亡。近年来发现国际间Psa的传播可能是通过花粉、幼苗等进出口方式进行传播。树干或枝条在感病后凸起开裂，染病部位的皮层初期溢出乳白色菌脓，后期形成黄褐色或锈红色粘液。感病叶片呈现褐色不规则或多角形病斑，周围常伴有黄色晕圈。花蕾感病后，部分不能开花，花蕾变褐枯死。即使开花结果，果小易造成落果、畸形果。

1.4 发生流行规律

病菌多从枝蔓及枝条等部位侵入，主要借助风雨、昆虫、苗木携带或农事操作进行传播。该病菌主要在病株组织中越冬，也可随病残体在土壤中越冬。猕猴桃溃疡病属于低温、高湿病害，冬季及初春温度的急剧变化，是导致溃疡病发生流行的关键因子，低温有利于该病发生，高温阻碍其流行。

1.5 综合治理

目前对猕猴桃溃疡病的防控主要采用综合治理措施，提前预防是防治其病害的关键。综合治理包括：①加强植物检疫工作。猕猴桃溃疡病作为一种全国检疫性森林病害，新建果园在栽培引种的过程中要确保外来苗木不携带溃疡病菌。②加强栽培管理。加强冬季的清园防治工作，进行农事操作时避免造成大量伤口。③选育和利用抗病品种。目前，利用优良的抗猕猴桃溃疡病品种是控制该病害最为有效和经济的措施。④化学药剂防治。使用化学药剂是目前防治溃疡病最主要、最直接的防治措施。国内众多研究者对溃疡病的室内及田间化学药剂的筛选做了大量工作，对有效试剂的使用等有诸多研究成果。

2 猕猴桃溃疡病检测技术研究概述

2.1 直接PCR检测技术

李智念等[3]优化PCR反应体系和反应程序，无需病原物培养和DNA提取过程，直接以猕猴桃枝条为样本进行PCR，使用紫外手电筒代替凝胶成像系统来判断。付博等[4]对猕猴桃溃疡病快速检测体系进行优化，样品病健交界处用金氏B培养液浸泡以及PCR体系中加入10%甘油，提升扩增效率。建立田间无症状样本快速检测，无症状带菌样品浸提液中加入Na2SO3，为猕猴桃溃疡病早期诊断提供技术支撑。

2.2 RT-PCR

刘芸宏[5]应用RT-PCR法检测Psa-V活菌，对于染菌花粉样品，增菌12h，灵敏度可达1.39×101CFU/g，该方法对陕西猕猴桃产区Psa-V活菌定量检测提供技术支撑。

2.3 荧光定量PCR技术

周大祥[6]研究叠氮溴乙锭EMA-qPCR是一种有效检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法，能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。刘芸宏[5]采用叠氮溴化丙啶PMA-qPCR结合，优化PMA最佳浓度为105μg/mL、培育时间为8min、曝光时间为20min，结果表明应用人工染菌后的枝条样品，最低检出限为6.30×104CFU/mL。谢锦添[7]等根据hrpW基因设计荧光定量PCR引物，扩增片段247bp，该方法可检测无病症枝条中最低浓度8.45×10-5ng/μL的PSA病原菌，对猕猴桃溃疡病感病样品的早期诊断提供帮助。

2.4 巢式PCR

曹凡[8]以Gallelli检测法为基础改进巢式PCR检测技术，对猕猴桃枝条、叶片、雄花Psa进行检测，结果表明有Psa典型症状的样品阳性率为76.67%，雄花Psa的阳性率为55%。无Psa典型症状的样品阳性率为41.67%，雄花Psa的阳性率为50%，该方法可以对早期Psa进行鉴定。

2.5 环介导等温扩增反应LAMP

王一波等[9]设计优化LAMP反应的检测体系，优势为特异性强、灵敏度高、设备简单、反应时间短以及结果可视化；能够特异性检测出Psa病原菌的灵敏度为100CFU/mL，LAMP能够检测猕猴桃溃疡病不同的发病部位，该方法能够广泛应用于田间的猕猴桃细菌性溃疡病快速检测。

2.6 血清学检测技术

郭丽倩[10]以猕猴桃溃疡病菌为免疫原，通过杂交瘤技术制备抗猕猴桃溃疡病菌的单克隆抗体，以单抗为核心建立可特异、灵敏检测猕猴桃溃疡病菌的ACP-ELISA、dot-ELISA血清学快速检测技术，该方法检测病菌的极限分别为0.9×102和3.6×103CFU/mL，为我国猕猴桃溃疡病的检测诊断和科学防治提供技术支撑。

3 讨论

虽然目前建立的Psa检测的方法有很多，但也存在一些应用推广的缺点，专业的检测机构具备专业人员和设备，而田间果农不具备专业的设备和检测技术，而且PCR技术存在检测结果假阳性，为了检测结果的真实可靠，应多种检测技术相结合。应重视关于猕猴桃溃疡病的早期检测，为猕猴桃溃疡病菌的潜伏期诊断、种群动态检测以及植物检疫工作提供技术参考。