贝莱斯芽孢杆菌对采后葡萄果实贮藏品质的影响

张雨萌，牛新湘，邹 强，杨红梅，楚 敏，史应武,4,5,*

（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院微生物应用研究所，新疆 乌鲁木齐 830091；3.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所，新疆 乌鲁木齐 830091；4.农业农村部西北绿洲农业环境重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830091；5.新疆特殊环境微生物实验室，新疆 乌鲁木齐 830091）

“玫瑰香”葡萄具有独特香气，常用于鲜食、酿酒等。每年8—9月份为“玫瑰香”葡萄成熟期，由于采收时正值高温，且果实含糖量极高，表皮容易损伤，极易受病原菌的侵害发生腐烂、变软、掉粒等现象[1-2]，导致贮藏期较短，贮藏品质大幅下降。我国需贮运外销与贮运保鲜的葡萄果实约占80%，每年在采收、包装、贮藏等环节出现的葡萄腐烂损失约占总产量的27%以上，造成严重的经济损失[3]。如何保持葡萄采后贮藏品质是目前亟需解决的问题。我国在葡萄果实采后贮藏保鲜技术方面已有不少研究，最常见的是使用SO2熏蒸来防止葡萄果实腐烂[4-5]，但此方法易使果实发生漂白[6]，且易腐蚀库房金属设施，危害人体健康[7]。Pinto等[8]采用UV-C辐射的方法，使葡萄抗氧化活性增加，从而达到保鲜目的，但果实经辐射处理可能会引起化学及生物学效应。因此寻求安全有效的保鲜技术是维持良好贮藏品质的关键。多数学者研究表明，拮抗菌对葡萄采后防腐保鲜有较好的效果，如：芽孢杆菌、酵母菌、假单胞杆菌等[9-11]。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）是芽孢杆菌属的一个新种，在2008年被确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）的后期异型体[12]。已经命名的甲基营养型芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌植物亚种应该重新归为B.velezensis。贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）是目前成功用于实际生产的生防菌之一，可产生蛋白、多肽、小分子量抗生素等多种抑菌物质，能有效防治草莓白粉病、兰花枯萎病等农业病害，对稻瘟病菌、链格孢菌等病菌有较强的拮抗活性[13-14]，表现出很好的实际应用效果与前景[15-16]，对葡萄采后病原菌的侵害也有明显抑制效果。Hamaoka等[17]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌KOF112可以抑制灰霉病菌、炭疽菌和晚疫霉的菌丝生长。B.velezensis这些特性使其在食品行业中也具有一定的应用潜力，但其在葡萄采后保鲜中的应用鲜有报道。

本试验以玫瑰香葡萄为试材，采用贝莱斯芽孢杆菌TP-1溶液处理葡萄，通过对果实失重率、腐烂率、可溶性固形物含量、相对电导率、硬度、果皮色度、可滴定酸（TA）含量、VC含量的测定，研究其对玫瑰香葡萄常温和低温贮藏品质的影响，探索葡萄采后保鲜处理的有效方法，以期为葡萄贮藏保鲜技术研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

拮抗菌：贝莱斯芽孢杆菌TP-1，分离自五家渠葡萄园土壤。病原菌：灰葡萄孢PH-23，由变质葡萄伤口处分离所得。葡萄：品种为玫瑰香，购自乌鲁木齐市沙依巴克区北园春水果市场，选取颗粒饱满，果实颜色较深且鲜艳，无损伤，大小相似的葡萄开展试验。其他材料：0.22μm有机滤膜、打孔器、玻璃珠、穿刺针、竹签。

酚酞：上海山浦化工有限公司。1%酚酞指示剂：将0.5 g酚酞用50 mL 95%乙醇充分溶解，得到1%酚酞指示剂，常温保存备用。氢氧化钠：天津永晟精细化工有限公司。0.1 mol/L NaOH溶液：取2.0 g氢氧化钠，置于洁净烧杯中，加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌助溶，将溶液全部转至500 mL容量瓶中定容，常温保存备用。

1.1.2 仪器与设备

UV-2550型紫外分光光度计，日本岛津自动化设备有限公司；NR10QC型通用色差计，深圳市三恩驰科技有限公司；FiveEasy Plus型pH计，北京东南仪诚实验室设备有限公司；GY-4型水果硬度计，浙江托普云农科技股份有限公司；DDS-307型电导率仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；CL20A型高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司；DH-9162型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；RXZ型智能人工气候箱，宁波江南仪器厂；DK-8D型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；WYT-A型手持折射仪，成都豪创光电仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液处理

将拮抗菌和病原菌的菌液分别于室温条件下，8 000 r/min离心15 min，收集菌体，用0.85%生理盐水重悬菌体，8 000 r/min离心15 min，收集菌体，重复操作洗涤菌体至少3次。然后用与菌液等量的生理盐水重悬菌体。

1.2.2 样品处理

葡萄表面用清水进行冲洗，去除灰尘后用2%次氯酸钠浸泡1 min，用无菌水冲洗，晾干。在葡萄果实表面均匀选取4点，用无菌针头进行打孔，孔深3 mm，将打孔后大小、成熟度均一的葡萄随机分为4组。①将葡萄置于无菌水中浸泡1 min，以此为对照组（CK），记为T1。②将葡萄在拮抗菌溶液（TP-1）中浸泡1 min，记为T2。③将葡萄先在拮抗菌溶液中浸泡1 min，然后在病原菌溶液（PH-23）中浸泡30 s，为（TP-1+PH-23），记为T3。④将葡萄在病原菌溶液（PH-23）中浸泡30 s，记为T4。所有试验均重复3次。将4组处理分别置于相对湿度为85%条件下贮藏，设置低温（4℃）及常温（25℃）两组处理，低温处理在10～50 d进行测定，常温处理在5～25 d进行测定。

1.2.3 测定项目与方法

1.2.3.1 腐烂率

采用计数法测定腐烂率，每个处理50粒葡萄果实。计算公式为：

腐烂率（%）=腐烂果粒数/总果粒数×100

1.2.3.2 失重率

采用称重法，具体参照吴帆等[18]的方法。低温（4℃）贮藏处理组每10 d取样一次，准确称重并记录。常温（25℃）贮藏处理组每5 d取样一次，准确称重并记录。

1.2.3.3 可溶性固形物（TSS）含量

利用WYT-A手持折射仪进行测定[19]。

1.2.3.4 相对电导率

使用DDS-307型电导率仪进行测定[20]。

1.2.3.5 硬度

参考叶爽等[21]的方法，采用GY-4型水果硬度计对葡萄进行穿刺测试。

1.2.3.6 果皮色度

参考孔祥佳等[22]的方法，使用NR10QC型通用色差计随机测定葡萄果实表面L*、a*、b*值，L*表示亮度，a*表示红绿色度，b*表示黄蓝色度。根据a*和b*值计算果皮的色饱和度C值，色饱和度代表果实色泽的鲜艳程度，该数值越大果实色泽越鲜艳。色饱和度C值计算公式为：C=（a*2+b*2）1/2。

1.2.3.7 可滴定酸（TA）含量

参考曹建康等[23]的方法，采用酸碱滴定法进行测定，以酒石酸计。

1.2.3.8 VC含量

参照袁王旬等[24]的方法，在420nm处测定吸光值。

1.2.4 数据处理

采用Excel 2010软件绘图，采用SPSS21.0软件进行数据统计分析。各指标的测定均重复3次。

2 结果与分析

2.1 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实感官指标的影响

2.1.1 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实的防腐效果

如图1所示，在整个贮藏期间葡萄果实腐烂率均呈现上升趋势，常温贮藏15～20 d时，腐烂率显著上升，但T2处理组的腐烂率始终低于其他处理组。T4处理组腐烂率增加最快，第25天时已经达到84%，约为T2组的2倍，T3处理组腐烂率在贮藏后期显著低于对照组（P＜0.05）。常温贮藏条件下，贝莱斯芽孢杆菌防腐效果明显。低温贮藏葡萄果实的腐烂率明显低于常温贮藏，贮藏50 d时腐烂率均不超过40%，且T2处理组腐烂率最低。贮藏25 d时，常温贮藏条件T2组的腐烂率为42.4%，贮藏50d时，低温贮藏条件T2组的腐烂率仅为27.4%。综上，贝莱斯芽孢杆菌可以有效抑制葡萄果实的腐烂。

图1 葡萄果实贮藏期间腐烂率的变化Fig.1 Changesin rottingrateof grapesduringstorage

2.1.2 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实失重率的影响

如图2所示，随着贮藏时间的延长，各组果实失重率均呈上升趋势，且两种贮藏条件下各贮藏阶段水分含量变化趋势较为一致。常温贮藏的葡萄失重率在贮藏15 d以后上升趋势显著，T4组失重率显著高于其他处理组（P＜0.05），而T1、T2组在贮藏10～15 d失重率迅速上升，此后缓慢上升，各处理组间表现出明显差异。第25天时T2组失重率为14.38%，显著低于其他3组（P＜0.05），此时T3组的失重率为25.03%，而T4组的失重率为31.99%，说明常温贮藏条件下贝莱斯芽孢杆菌可以大幅降低葡萄果实失重率。葡萄在低温贮藏期间的失重率整体呈均匀上升趋势，且T4处理组失重率始终显著高于其他处理组（P＜0.05），T2组果实失重率始终低于T1组（P＜0.05），说明贝莱斯芽孢杆菌TP-1可有效抑制低温贮藏下葡萄果实的失重。

图2 葡萄果实贮藏期间失重率的变化Fig.2 Changesin weight lossrate of grapes during storage

2.1.3 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果皮色度的影响

如图3所示，常温贮藏过程中各处理组L*值差异不大，贮藏15 d以后T2组的L*值始终低于其他处理组，贮藏25 d时T4处理组L*值最高，为31.34。葡萄果实低温贮藏50 d时，T1、T2、T3组间L*值无明显差异，T4组L*值为33.65，显著高于其他3组（P＜0.05）。常温贮藏葡萄果实T1、T2、T3处理组的C值均呈先下降后上升的变化趋势，T4处理组的C值在贮藏25 d时显著上升。低温贮藏的各处理组C值整体呈上升趋势，第50天时T4处理组C值最大。试验结果表明，不同贮藏条件下葡萄果皮明暗程度无明显变化，低温贮藏的葡萄颜色更为鲜艳。

图3 葡萄果实贮藏期间果皮色度的变化Fig.3 Changesin grape skin color duringstorage

2.1.4 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实硬度的影响

如图4所示，随着贮藏时间的延长，葡萄果实硬度呈现下降趋势，硬度的保持效果为T2＞T1＞T3＞T4，常温下贮藏的葡萄果实硬度下降更快。常温T4处理组硬度下降最快，第25天时硬度为0。在低温贮藏过程中，果实硬度呈现均匀下降的趋势，其中T3组硬度始终高于T4处理，可见低温贮藏条件下贝莱斯芽孢杆菌可以更好地维持葡萄果实硬度。上述结果说明贝莱斯芽孢杆菌可以较好地维持果实细胞间结合力和果实的抗压力[25]。

图4 葡萄果实贮藏期间硬度的变化Fig.4 Changesin thehardnessof grapesduringstorage

2.2 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实营养指标的影响

2.2.1 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实可溶性固形物含量的影响

如图5所示，常温贮藏期间葡萄果实的可溶性固形物含量整体呈下降趋势。其中常温贮藏条件T4处理组下降幅度更大。常温贮藏25 d时，可溶性固形物含量由高到低依次为：T2＞T3＞T1＞T4。低温贮藏条件下前20 d可溶性固形物含量呈下降趋势，20～50 d有所上升，低温贮藏50 d时可溶性固形物含量由大到小为：T2＞T1＞T3＞T4，说明葡萄果实在贮藏过程中甜度呈下降趋势，但拮抗菌处理组可延缓果实代谢活动[26]，有效维持葡萄的甜度。

图5 葡萄果实贮藏期间可溶性固形物含量的变化Fig.5 Changesof soluble solidscontents in grapesduring storage

2.2.2 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实VC含量的影响

如图6所示，常温贮藏条件下各组葡萄的VC含量呈现下降趋势，15 d时下降幅度较大，其中T2处理组对维持VC含量最有优势，贮藏25 d时，各处理组VC含量由高到低依次为：T2＞T3＞T1＞T4；低温贮藏葡萄果实VC含量整体呈下降趋势，贮藏50 d时，VC含量由高到低依次为：T2＞T3＞T1＞T4。常温贮藏前期VC含量大于低温贮藏，但随着贮藏时间延长，常温贮藏VC含量下降较快，而低温贮藏在整个贮藏期间VC含量下降幅度缓慢，贮藏中后期低温贮藏条件下VC含量高于常温贮藏，且T2处理组的VC含量始终最高。表明生物保鲜与低温保鲜结合可以较好地维持葡萄果实中VC含量，有助于葡萄果实长期贮藏。

图6 葡萄果实贮藏期间VC含量的变化Fig.6 Changesof VCcontentsin grapesduringstorage

2.2.3 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实可滴定酸含量的影响

如图7所示，在整个贮藏期间葡萄果实可滴定酸含量呈现持续下降的趋势。常温贮藏25 d时，各处理可滴定酸含量由高到低依次为：T2＞T1＞T3＞T4；低温贮藏的葡萄果实可滴定酸含量较常温贮藏降幅平缓，第50天时，各处理由高到低依次为：T3＞T2＞T1＞T4。由此可见，贝莱斯芽孢杆菌TP-1可有效抑制葡萄果实贮藏期间可滴定酸含量的下降，且低温贮藏较常温贮藏更有利于减缓可滴定酸含量的下降。

图7 葡萄果实贮藏期间可滴定酸含量的变化Fig.7 Changesin titratableacids contentsin grapes during storage

2.3 贝莱斯芽孢杆菌TP-1对贮藏期间葡萄果实生理指标的影响

由于葡萄果实不断成熟衰老，其果肉的相对电导率随着贮藏时间的延长逐渐上升（图8）。常温贮藏25 d时，T4处理组的相对电导率显著高于其他3组（P＜0.05），而T2处理组显著低于其他3组（P＜0.05）。低温贮藏50 d时，相对电导率由大到小依次为：T4＞T3＞T1＞T2，T2处理组显著低于其他3组（P＜0.05）。常温贮藏果实的相对电导率略高于低温贮藏的果实。推测葡萄在贮藏期间相对电导率迅速增大，破坏了葡萄果实组织膜结构，发生膜内电解质外泄。贝莱斯芽孢杆菌TP-1可以显著抑制细胞膜的损伤。

图8 葡萄果实贮藏期间相对电导率的变化Fig.8 Changesin the electrical conductivity of grapesduring storage

3 讨论

贝莱斯芽孢杆菌含有多种菌肽基因组，大量研究报道了其生防潜力，但在果实贮藏保鲜方面应用很少。潘梦诗等[27]研究了贝莱斯芽孢杆菌对花生白绢病的生防机理，结果表明，贝莱斯芽孢杆菌产生的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和嗜铁素可抑制病原菌的生长。有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌可以抑制厚皮甜瓜上尖孢镰刀菌的生长，有效抑制甜瓜腐烂[28]。本研究中，贝莱斯芽孢杆菌TP-1处理后葡萄果实腐烂率在整个贮藏期都处于较低水平，这可能是由于贝莱斯芽孢杆菌抑制了病原菌的生长，从而延缓了发病时间。

果实的失重率、硬度和色度是保鲜研究中常用的感官指标[29]，可以反映葡萄果实的衰老程度、果实品质以及颜色变化。本研究中贝莱斯芽孢杆菌TP-1处理能够有效减少葡萄果实水分的散失，且常温贮藏条件下效果更显著。硬度可以表征果实抗压能力的强弱，在果实成熟的过程中其组织结构变得松弛，硬度下降[30]。有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1可以显著降低乙烯释放量，有效控制番茄采后软化，维持较好的硬度[31]。本研究中，贝莱斯芽孢杆菌TP-1处理在整个贮藏期间硬度呈现缓慢下降趋势，常温贮藏25 d时，贝莱斯芽孢杆菌TP-1处理的硬度是对照组的1.42倍，低温贮藏条件下贝莱斯芽孢杆菌TP-1处理与对照组硬度均无大幅下降。整个贮藏期间果实表面亮度小幅上升，色泽逐渐变浅，低温贮藏较常温贮藏相比，葡萄果实颜色更为鲜艳，这与在梨[32]、猕猴桃[33]、苹果[34]等水果的研究结果大体一致。果实组织的相对电导率反映了组织细胞膜的完整性与衰老程度[35]。本研究中，在整个贮藏期间葡萄果实组织的相对电导率保持上升趋势，且贝莱斯芽孢杆菌TP-1处理组始终低于其他处理组。导致果实相对电导率上升的原因可能是离子的渗透率增加，致使细胞膜的组织结构被破坏[36]。本研究中，两种贮藏温度条件下果实可溶性固形物含量均有不同程度的下降，低温贮藏条件可以延缓果实可溶性固形物含量的下降，可溶性固形物含量的变化可能与贮藏期间葡萄果实内部糖的转化有关[37]。

孙思胜等[38]研究表明，对于低温贮藏的“夏黑”葡萄，采用不同浓度复方中药提取物可以有效抑制可滴定酸含量的下降，该结论与本研究结果一致。VC是衡量果实营养价值的重要指标。本试验中，整个常温贮藏期间果实VC含量大幅下降，贝莱斯芽孢杆菌TP-1处理组VC含量显著高于对照组（P＜0.05），说明贝莱斯芽孢杆菌TP-1处理可以延缓VC的降解，有效维持果实的营养。低温贮藏条件下VC含量无明显变化，推测可能是由于低温抑制了抗坏血酸酶的活性，进而减缓了VC含量的下降[39]。

贝莱斯芽孢杆菌TP-1在常温贮藏条件下维持葡萄果实品质效果更明显，低温贮藏条件下有关贝莱斯芽孢杆菌贮藏保鲜的机理还需进一步研究。

4 结论

贝莱斯芽孢杆菌TP-1可以有效抑制采后葡萄果实腐烂率、失重率和相对电导率的上升，并且结合低温贮藏条件可以有效延缓葡萄果实硬度、可滴定酸含量、可溶性固形物含量和VC含量的下降，使葡萄果实保持良好的色度。常温贮藏较低温贮藏防腐和维持果实品质的效果更明显，但低温贮藏条件可以延长葡萄果实的贮藏期。贝莱斯芽孢杆菌TP-1结合低温贮藏的方法可以有效改善“玫瑰香”葡萄果实的贮藏品质。