响应面法优化柿子多糖超声波提取工艺及抗氧化活性研究

王 辉，句荣辉，王 丽，朱建晨，汪长钢

（北京农业职业学院，北京 102442）

柿子是我国重要的农产品，含有丰富的营养物质，其中维生素、矿质元素、碳水化合物等物质含量较高，具有预防心血管疾病、化痰润肺、控制血压等保健作用[1-2]。中医学提出，柿子味甘、涩，性寒，归肺经。其味甘而气平，性涩而能收，故有健脾涩肠，治嗽止血之功[3-5]。柿子中含有的多糖较为丰富，具有一定的抗氧化作用，不仅可以很好地给身体补充营养，而且还有抗衰老以及强效护心的作用。

多糖是一种高分子聚合物，通过10个以上单糖糖苷键连接而成，故生物活性较为突出，相关研究成果已应用于生物医药材料领域[6-8]。多糖具有一定的免疫调节、抗病毒及抗癌、乳化、美容、降血糖、抗氧化等作用，常常由略带修饰的重复单元构成。由于结构不同，多糖高分子和构成它的单糖分子性质迥异，可能无定形，甚至不溶于水。多糖属于天然大分子化合物，在自然界分布相当广泛，存在于大多植物、动物及微生物中[9-11]。因此，研究和开发多糖资源，解析多糖构成与药理作用等，均有极为重要的现实意义。

超声波提取是一种高效、安全的有效成分提取方法[12-13]，其具有一定的机械作用，可分散破坏植物组织，加速溶剂穿透组织作用，提高有效成分提取率[14]。超声波提取法效率高，安全环保，营养成分损失少，设备简单易操作，是值得研究的提取技术[15]。本文以磨盘柿为试验材料，采用超声波提取法提取柿子多糖，采用响应面法优化其提取工艺，最后对柿子多糖抗氧化性进行对比研究，以期为柿子多糖在功能保健食品中的应用提供理论和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

磨盘柿，经去皮去核后切片，脱水干燥至恒重，破碎后过65目筛，置于干燥皿中密封保存，备用。

试验用水：试验用水应符合GB/T 6682—2008中三级水的规定；硫酸（H2SO4）、无水乙醇（C2H5OH）、苯酚（C6H6O）、葡萄糖（C6H12O6）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、邻二氮菲、过氧化氢（H2O2）、硫酸铁（FeSO4）、抗坏血酸、还原型辅酶I二钠盐（NADH）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：均为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

DHC-9053A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；JYL-A070型匀浆机，九阳股份有限公司；DL-360B型超声波清洗机，上海之信仪器有限公司；HH-4型恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HC-3018型高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；Q5866型涡旋振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；FA1104N型分析天平，上海菁海仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

柿子洗净→去核切片→烘干→破碎→加水超声波提取→提取液离心→上清液用乙醇沉淀→过滤沉淀→干燥→柿子多糖粗品

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 原料处理

将柿子粉用滤纸分批包好，配制成一定比例的待提取液，柿子烘干粉要尽量粉碎，不要留大块，以便柿子多糖提取完全。

1.2.2.2 多糖的浸提

提取时避免温度浮动过大，尽量缩短提取时间，减少料液受热时间，以降低多糖分解的机会。

1.2.2.3 醇沉

将乙醇慢慢注入冷却后的提取液中，此时柿子多糖呈现絮状凝胶物沉淀析出，边加边搅至完全混合均匀，静置过夜，然后过滤得沉淀物。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 料液比对柿子多糖提取的影响

取5份柿子粉各2g，分别加入20、30、40、50、60mL蒸馏水后，摇匀，于70℃水浴，超声功率300 W条件下提取30 min，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））对柿子多糖得率的影响。

1.2.3.2 提取温度对柿子多糖提取的影响

取5份柿子粉各2 g，溶于40 mL的蒸馏水中，于超声功率300 W条件下提取30 min，考察不同提取温度（50、60、70、80、90℃）对柿子多糖得率的影响。

1.2.3.3 超声功率对柿子多糖提取的影响

取5份柿子粉各2 g，溶于40 mL的蒸馏水中，于60℃水浴中提取30 min，考察不同超声功率（100、200、300、400、500 W）对柿子多糖得率的影响。

1.2.3.4 超声时间对柿子多糖提取的影响

取5份柿子粉各2 g，溶于40 mL的蒸馏水中，在60℃水浴及超声功率为300 W的条件下提取，考察不同超声时间（10、20、30、40、50 min）对柿子多糖得率的影响。

1.2.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，利用响应面法优化磨盘柿多糖的提取工艺，通过拟合二次多项式，计算出最佳工艺组合和该条件下磨盘柿多糖提取率的最大理论值[16]。

使用Design-Expert8.0软件的Box-Behnken Design（BBD）进行试验设计[17]。自变量为料液比（A）、提取温度（B）、超声功率（C）和提取时间（D），低、中、高水平分别用-1、0、1表示，详见表1。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Response surface factorsand levels

1.2.5 验证试验

根据响应面试验得到最优工艺参数，进行3次柿子多糖提取验证试验，以平均多糖得率作为验证值。

1.2.6 测定项目与方法

1.2.6.1 磨盘柿多糖得率

准确吸取10μg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别加入10 mL刻度试管中，用蒸馏水补至1.0 mL。向试液中加至1.0 mL 5%苯酚溶液，快速加入5.0 mL硫酸溶液，静置10 min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管静置于30℃水浴锅中反应20 min，测定波长为490 nm处的吸光度值，并以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

采用苯酚-硫酸法[18]对磨盘柿的多糖含量进行测定。将磨盘柿提取物按一定比例进行稀释，用标准曲线法测定490 nm处的吸光度值。使用回归方程计算多糖浓度后，确定多糖得率，样品中多糖得率计算公式为：

式中：m1为从标准曲线查得的葡萄糖质量，μg；V1为样品定容体积，mL；m2为样品质量，g；V2为测定用样品液的体积，mL；0.9为换算系数。

1.2.6.2 羟基自由基清除率

将超声波所提取的柿子多糖样品分别配制成质量浓度为1、2、3、4、5 mg/mL的5种溶液[19]。在微孔板中加入50μL不同质量浓度的样品溶液，分别加入100μL PBS缓冲液（0.2 mol/L、pH 7.4）、50μL邻二氮菲（0.75 mmol/L）、50μL体积分数0.01%的H2O2溶液、50μL FeSO4溶液（0.75 mmol/L），摇匀后，在37℃下存放30 min，测定536 nm波长处的吸光度值，同时以同浓度的VC作对照。羟基自由基清除率计算公式为：

式中：A1为样品的吸光值；A0为空白对照试验（水代替多糖溶液）的吸光值；A2为蒸馏水替代H2O2和多糖的吸光值。

1.2.6.3 超氧阴离子自由基清除率

在微孔板中加入50μL不同质量浓度的样品溶液，分别加入50μL NADH溶液（468μmol/L）、50μL NBT溶液（156μmol/L）及50μL PMS溶液（60μmol/L），混合后，在25℃水浴5 min，测定560 nm波长处的吸光度值，同时以同浓度的VC为对照。超氧阴离子自由基清除率计算公式为：

式中：A0为空白对照试验（水代替多糖溶液）的吸光值；A1为样品试验的吸光值；A2为样品干扰试验（0.2 mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲溶液代替NBT溶液）的吸光值。

1.2.6.4 DPPH自由基清除率

在微孔板中加入50μL不同质量浓度的样品溶液，分别加入100μL水、15μLDPPH溶液（0.4 mmol/L），摇匀后，在避光条件下存放30 min，测定517 nm波长处的吸光度值，同时以同浓度的VC为对照。DPPH自由基清除率计算公式为：

式中：A0为空白对照试验（水代替多糖溶液）的吸光值；A1为样品试验吸光值；A2为样品干扰试验（无水乙醇代替DPPH）的吸光值。

1.2.7 数据处理

所有试验均重复3次，使用Excel软件进行数据分析，采用Design-Expert 8.0软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对柿子多糖得率的影响

由图1可知，在超声波提取过程中，随着溶液比例的增加，多糖得率也不断增加，可能是随着溶剂水的用量增大，有利于多糖的溶出，料液比从1∶10（g/mL）到1∶20（g/mL）多糖得率增幅较快，继续增加水的用量，多糖得率增幅放缓。考虑减少工作量和操作成本，选择料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）进行后续响应面试验。

图1 料液比对柿子多糖得率的影响Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the yield of persimmon polysaccharide

2.1.2 提取温度对柿子多糖得率的影响

由图2可知，随着超声波提取温度的升高，多糖浸出速度加快，浸出多糖增多，多糖得率在水浴处理60℃时达到最大值，但继续升高温度，多糖得率逐渐减小，可能是高温破坏了多糖的生物结构，影响了其活性。故选择适宜提取温度为60℃进行后续试验。

图2 提取温度对柿子多糖得率的影响Fig.2 Effect of different extraction temperatureson theyield of persimmon polysaccharide

2.1.3 超声功率对柿子多糖得率的影响

由图3可见，随着超声功率的增大，多糖得率先上升后下降。超声功率由200 W提高到300 W时，多糖得率出现了较大幅度的升高，在300 W时多糖得率达到最大值，可能是因为随着超声功率增大，多糖溶出较多，但当超声功率超过300 W时，多糖溶出趋于平缓，且杂质溶出较多，浸提液的浑浊度增加，使多糖得率下降。因此，选择适宜超声功率为300 W进行后续试验。

图3 超声功率对柿子多糖得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of persimmon polysaccharide

2.1.4 提取时间对柿子多糖得率的影响

由图4可见，多糖得率随提取时间的延长而上升，20 min时达到最大值，之后继续延长提取时间，得率整体呈下降趋势，这可能是由于当浸提时间超过20 min后，多糖在水中的溶出趋于平衡，而杂质溶出较多，多糖得率反而降低。因此选择适宜超声提取时间为20 min进行后续试验。

图4 不同提取时间对柿子多糖得率的影响Fig.4 The effect of different extraction time on the yield of persimmon polysaccharide

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果与方差分析

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken中心组合设计原理，以料液比（A）、提取温度（B）、超声功率（C）和提取时间（D）为自变量，以柿子多糖得率为响应值，进行四因素三水平响应面优化试验，试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表2 响应面试验设计方案及结果Table2 Design optionsand resultsof theresponsesurface experiments

由表3方差分析可见，从试验数据中获得的模型F值为3.48，P值为0.013 1，表明该模型具有显著性。模型中一次项D影响极显著（P＜0.01），一次项A、二次项C2、交互项AD、BD影响显著（P＜0.05）。

表3 响应面方差分析表Table 3 Response surface analysisof variance

通过对表2中的结果进行数据回归拟合，得到超声波处理后多糖得率的回归方程为：

Y=16.56-1.19A-0.40B+0.48C-1.71D-0.30AB+0.25AC+2.18AD-0.85BC+1.90BD+1.00CD-0.60A2-0.42B2-1.79C2-0.58D2，其方程的R2=0.776 7。在此模型中，失拟项不显著，表明该回归模型与实测值有较高的拟合度。

2.2.2 各因素间的交互作用对响应值的影响

为探究各变量之间的交互作用及其对响应值的影响，以回归方程为依据，分别根据因素交互情况绘制每两个因素固定于零水平条件下[20]，另外两个因素交互作用形成的响应曲面图，如图5～10所示。

图5 料液比与提取温度的交互作用对柿子多糖得率的影响Fig.5 Effect of the interaction between material to liquid ratio and extraction temperatureon theyield of persimmon polysaccharide

图6 料液比与超声功率的交互作用对柿子多糖得率的影响Fig.6 Effect of the interaction between material to liquid ratio and ultrasonic power on theyield of persimmon polysaccharide

图8 提取温度与超声功率的交互作用对柿子多糖得率的影响Fig.8 Effect of theinteraction between extraction temperatureand ultrasonic power on the yield of persimmon polysaccharide

图10 超声功率与提取时间的交互作用对柿子多糖得率的影响Fig.10 Effect of the interaction between ultrasonic power and extraction timeon theyield of persimmon polysaccharide

由图5～10可以看出，图7和图9曲面的坡度比较陡，说明料液比与提取时间、提取温度与提取时间的交互作用对柿子多糖得率影响显著（P＜0.05）。根据响应面分析结果，预测柿子多糖得率的最大值为20.0%，最佳提取工艺条件为：料液比1∶15（g/mL），提取温度55℃，超声功率300 W，提取时间15 min。

图7 料液比与提取时间的交互作用对柿子多糖得率的影响Fig.7 Effect of the interaction between material to liquid ratioand extraction time on the yield of persimmon polysaccharide

图9 提取温度与提取时间的交互作用对柿子多糖得率的影响Fig.9 Effect of the interaction between extraction temperature and extraction timeon theyield of persimmon polysaccharide

2.3 验证试验

在响应面优化试验得到的最优工艺参数条件下进行柿子多糖提取验证试验，测定3次重复试验的多糖得率，得到柿子多糖得率平均验证值为19.9%，与响应面试验预测最大值20.0%接近，说明该模型能预测实际多糖得率。

2.4 柿子多糖体外抗氧化活性测定

2.4.1 柿子多糖对羟基自由基的清除作用

由图11可见，当柿子多糖质量浓度为0.5 mg/mL和2.0 mg/mL时，其对羟基自由基的清除率分别为42.4%和84.6%，最高清除率为88.50%。VC质量浓度在0.5 mg/mL和2.0 mg/mL时对羟基自由基清除率分别为45.7%和92.7%。可以看出，柿子多糖和VC对羟基自由基均有较强的清除作用，在一定范围内，清除效果与质量浓度之间成正比，但质量浓度高于2.0 mg/mL时，二者清除率的增加均减缓。柿子多糖抗氧化能力不及VC，但是对羟基自由基的清除率也较高，具有较强的应用潜力[21]。

图11 柿子多糖及VC对羟基自由基的清除作用Fig.11 Scavenging effect of persimmon polysaccharide and VCon hydroxyl free radicals

2.4.2 柿子多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

由图12可见，当柿子多糖质量浓度为0.5 mg/mL和2.0 mg/mL时，其对超氧阴离子自由基的清除率分别为56.6%和78.8%，最高清除率为81.21%。VC质量浓度在0.5 mg/mL和2.0 mg/mL时对超氧阴离子自由基清除率分别为83.4%和92.7%。可以看出，柿子多糖和VC对超氧阴离子自由基均有较强的清除作用，在一定范围内，清除效果与质量浓度之间成正比，但当质量浓度高于2.0 mg/mL后，二者清除率的增加均减缓。柿子多糖对超氧阴离子自由基的清除率始终低于VC。

图12 柿子多糖及VC对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.12 Scavengingeffect of persimmon polysaccharideand VCon superoxide anion free radical

2.4.3 柿子多糖对DPPH自由基的清除作用

由图13可见，当柿子多糖质量浓度为0.5 mg/mL和2.5 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率分别为49.6%和78.6%，最高清除率为79.10%。VC质量浓度为0.5 mg/mL和2.5 mg/mL时对DPPH自由基清除率分别为67.4%和91.6%。可以看出，柿子多糖和VC对DPPH自由基都具有很强的清除作用，在一定范围内，清除作用随着质量浓度的增加而增强，但质量浓度高于2.5 mg/mL后，二者清除率的增加趋势减缓。柿子多糖对DPPH自由基的清除率始终低于VC。

图13 柿子多糖及VC对DPPH自由基的清除作用Fig.13 Scavengingeffect of persimmon polysaccharideand VCon DPPH free radical

3 结论与讨论

本研究采用超声波辅助提取技术提取磨盘柿中的多糖，在单因素试验的基础上，通过响应面分析，得到最优工艺参数为：料液比1∶15（g/mL），提取温度55℃，超声功率300 W，提取时间15 min。在该工艺条件下柿子多糖得率预测值为20.0%，验证值为19.9%。其中提取时间对多糖得率的影响最大，可能是因为过长的提取时间会使柿子多糖结构遭到破坏[22]。

试验研究结果表明，柿子多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用，最高清除率分别为88.50%、81.21%、79.10%。这表明本试验制备的柿子多糖具有较强的抗氧化作用，可作为一种天然抗氧化剂加以研究并应用于功能保健食品中。然而本试验只在体外对3种自由基的清除效果进行了研究，而对于生物体内柿子多糖是否具有同样的抗氧化效果，还有待于进一步的深入研究。