生物活性玻璃/氧化海藻酸钠/明胶复合水凝胶的制备及性能*

2022-11-29曲景成曲景双

化工科技 2022年4期

曲景成,曲景双,丁伟

(东北石油大学化学化工学院石油与天然气省化工重点实验室,黑龙江大庆 163318)

伤口愈合是一个动态过程,敷料的性能要求会随着愈合的进展而变化。传统敷料用于伤口处理,其主要功能是让伤口渗出液蒸发,防止有害细菌进入,从而保持伤口干燥。然而,温暖潮湿的环境才有助于快速愈合,大多数现代伤口敷料产品的设计都是为了满足这些条件[1-2]。Quinn[3]、Kane[4]、Choi[5]、Li[6]、Azad[7]、Kicho[8]等制备了聚环氧乙烯和水、琼脂和聚丙烯酰胺、聚乙烯醇组成的海绵、聚氨酯泡沫、聚四氨乙烯薄膜、美乐林等复合敷料。

水凝胶是三维(3D)、不溶性、交联的组织状聚合物网络,能够在膨胀状态下保留大量水[9-11],增加其体积,并表现出大量不同的材料行为。自20世纪60年代首次实际应用以来,已被应用于生物医学的多个领域[12-14]。在伤口敷料[15-16]中水凝胶结合了湿润伤口愈合和液体吸收良好的特点,并且透明,可以有效监测愈合情况。

在最近的一项研究中,发现通常在水凝胶的制备中由于使用有毒性的交联剂,难以应用于含有活细胞的构建体。而高碘酸盐氧化海藻酸盐和明胶之间不需要加入交联剂就能迅速产生原位形成的水凝胶,无毒且可生物降解,证明了其作为可注射原位形成支架用于组织工程和药物输送的潜力。藻酸盐和明胶都已用于许多生物医学应用,例如伤口敷料、组织工程和药物输送[17]。而海藻酸盐明胶水凝胶由于其较低的机械强度在医学领域中并未得到广泛的应用[18]。因此作者研究制备了一种掺杂生物活性玻璃且能够自修复的水凝胶。首先原位合成氧化海藻酸钠/明胶(OSA/Gelatin)水凝胶,再将不同粒径大小的生物活性玻璃(BG)掺杂到上述所制备的OSA/Gelatin水凝胶中。该材料具有许多伤口敷料所需要的关键元素,如良好的吸水性能、自修复性能、最佳的水蒸气透过率、降解性能和力学性能等。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

海藻酸钠(SA)、高碘酸钠、明胶、苏丹明B、无水乙醇、乙二醇:分析纯,阿拉丁(上海)试剂有限公司;生物活性玻璃(纳米级BG-1)[19]、生物活性玻璃(微米级BG-2)[20]、去离子水:实验室自制。

核磁共振氢谱仪(1HNMR):AVANCE400,JEOL日本;场发射扫描电子显微镜(SEM):Vega 3,Tescan,德国卡尔蔡司股份公司;傅里叶变换红外光谱仪:Tensor-27,沈阳万方中通商贸有限公司;流变仪:MCR 501S,奥地利Anton Paar;X射线衍射仪:D/MAX 2200,牛津仪器公司;万能试验机:WDW-5,苏州泛思仪器设备有限公司。

1.2 生物活性玻璃/海藻酸盐/明胶水凝胶的合成

氧化海藻酸钠(OSA)的制备。将1 g海藻酸钠和5 m L乙醇在磁力搅拌的状态下形成比较分散的悬浊液,为溶液A;然后将一定量的高碘酸钠和去离子水避光制成0.5 mol/L的溶液B;将B溶液缓慢加入A中,黑暗条件下继续反应5 h,终止反应时加入乙二醇溶液终止15 min,得到溶液C,再将溶液C倒入透析袋中用去离子水透析3 d,定时更换去离子水,透析后倒入表面皿中,在－20℃的冰箱中预冷冻12 h并将样品放在－70℃的冻干机中进行冷冻干燥,从而获得OSA白色样品。n(高碘酸钠)∶n(SA)＝0.2,试样记为OSA-1,n(高碘酸钠)∶n(SA)＝0.6,试样记为OSA-2。

生物活性玻璃/海藻酸盐/明胶(BG/OSA/Gelatin)水凝胶的合成。称取适量的明胶加入到去离子水中,t＝50℃水浴锅中磁力搅拌,待完全溶解后,再加入0.05 g的生物活性玻璃粉末,继续搅拌使其均匀分散。温度下降至37℃加入一定量的OSA,反应一段时间后将搅拌均匀的混合液倒置于模具中,于37℃恒温箱中10 min,即可得到BG/OSA/Gelatin。选用BG-1、OSA-1、明胶所制备的水凝胶为水凝胶1;BG-2、OSA-1、明胶所制备的水凝胶为水凝胶2,选用BG-1、OSA-2、明胶所制备的水凝胶为水凝胶3,BG-2、OSA-2、明胶所制备的水凝胶为水凝胶4。

1.3 表征与测试

1.3.1 结构表征

以氧化氘为溶剂,用1H NMR对聚合物的化学结构进行了表征,测试条件为400 MHz。采用溴化钾压片法,通过傅里叶红外光谱仪在室温下对BG、OSA、Gelatin和所制备的BG/OSA/Gelatin水凝胶样品进行测试,波数为500~4 000 cm－1。

1.3.2 水凝胶形貌表征

为了表征水凝胶的微观结构,通过在20 k V下操作的SEM观察冷冻干燥和破裂的水凝胶碎片。在观察之前,样品表面喷金处理。

1.3.3 水凝胶流变性能测试

用流变仪研究了BG/OSA/Gelatin水凝胶在37℃振荡模式下的流变行为,频率扫描测试为0.1~100 rad/s。

1.3.4 水凝胶自修复性能测试

将水凝胶制成直径为20 mm,高为5 mm的圆柱体并用罗丹明B染色,然后将染色的水凝胶和未染色的水凝胶从中间切开并拼接到一起,t＝25℃放置一定时间后,观察BG/OSA/Gelatin水凝胶的自修复性能。

1.3.5 水凝胶吸水性能测试

将4种水凝胶浸泡在Na2HPO4·KH2PO4·NaCl和KCl(PBS)缓冲液中,t＝37℃浸泡一段时间取出后用滤纸擦掉样品上多余水分,称其质量,间隔一段时间再进行称量,若称取样品的质量未增加,则认为水凝胶已达到溶胀平衡,溶胀平衡后的质量记为mw。然后将样品预冷冻6 h,在－70℃的冷冻干燥机进行冷冻干燥后所得固体称重,记为mD。水凝胶的吸水率见式(1)。

1.3.6 水凝胶力学性能测试

(1)拉伸实验。将未加入生物活性玻璃制备成的水凝胶和加入生物活性玻璃的4种水凝胶试样制成为长条状,长、宽、高分别为40、13、2 mm,拉伸速度为10 mm/min,直至试样断裂,得到水凝胶伤口敷料的抗拉强度。

(2)压缩实验。将4种水凝胶制成直径为10 mm,高为5 mm的圆柱体。新制的样品在潮湿条件下测量,压缩速率为1 mm/min,压至水凝胶破裂或加载到最大压力,可得到其破裂强度。每个样品取3次测量的平均值。

1.3.7 水凝胶降解性能测试

利用p H＝7.4的PBS溶液作为模拟体液,测定水凝胶体外降解性能。将1.2制得的水凝胶冷冻干燥处理,获得冻干水凝胶,称其质量记为m1,之后将其浸泡在PBS溶液中,放置在37℃恒温箱中。一段时间后,将水凝胶试样从PBS溶液中取出并进行冷冻干燥,称其质量记为m2,降解过程中试样的质量损失率见式(2)。

1.3.8 水凝胶水蒸气透过率(WVTR)测试

采用标准方法ASTM E96对复合水凝胶试样测试其水蒸气透过率(WVTR)。首先,在玻璃瓶中加入3 g CaCl2,作为吸水剂。将样品固定在玻璃瓶上,测量瓶口直径记为2R,将装有CaCl2的玻璃瓶烘干至质量恒定并称量,记为m3,再将装有CaCl2的玻璃瓶放在恒温恒湿的培养箱中,温度为37℃。24 h后,称量装有CaCl2的玻璃瓶质量,记为m4。复合水凝胶的水蒸气透过率计算见式(3)。

2 结果与讨论

2.1 水凝胶的合成与表征

OSA的制备原理见图1。高碘酸钠具有强氧化性,能够氧化具有邻羟基的结构,使其氧化成醛基或酮。

图1 氧化海藻酸钠制备原理

SA、OSA、Gelatin、BG、BG/OSA/Gelatin水凝胶的红外谱图见图2。

图2 SA、OSA、GeIatin、BG、BG/OSA/GeIatin水凝胶的红外谱图

由图2可知,与SA红外谱图相比,1 733 cm－1出现了新的特征峰,为醛基的伸缩振动吸收峰,表明对海藻酸钠改性成功。OSA在1 733 cm－1醛基特征振动吸收峰在Gelatin的谱图上消失,说明在Gelatin的形成过程中形成新的化学键。Gelatin由于含有酰胺键,1 645、1 401 cm－1均出现了特征峰。而Gelatin的红外谱图上1 415 cm－1出现了应归属于Schiff碱结构的新的强吸收峰。BG在1 057、1 673、1 986 cm－1的振动吸收峰均在Gelatin 1 148、1 621、2 476 cm－1发生了红移和蓝移。表明BG与Gelatin/OSA之间产生了非共价键作用。4种水凝胶的红外谱图中均有相应的官能团对应,所以只选择1种水凝胶为例。

SA、OSA的核磁共振氢谱图见图3。

图3 SA、OSA核磁共振氢谱图

由图3可知,δ＝4.45为溶剂重水的质子吸收峰,δ＝5.14、5.57为醛基与羟基结合形成的半缩醛质子吸收峰,核磁谱图进一步表明成功制备了OSA。

2.2 水凝胶微观形态分析

4种复合水凝胶的扫描电镜图见图4。

由图4可知,试样具有多孔结构且彼此连通,说明组分间的相容性较好。其中水凝胶1和2中的海藻酸钠氧化度较低导致孔径较大,而水凝胶3比水凝胶1所形成的网络更致密是由于水凝胶3中SA的氧化度较大,同一区域内水凝胶试样的多孔结构不断增加,这是由于氧化度大的SA为明胶提供了更多的交联位点,使OSA中的醛基增多,与明胶中的氨基形成的亚胺键变多,水凝胶交联密度变大,同一区域内多孔结构变多,孔径变小。掺入BG-2后,孔径有所增大,可能是BG-2的粒径较大,影响了OSA的醛基与明胶的氨基相遇的几率,使其结合不够紧密,因此孔径增大。

图4 4种复合水凝胶的微观形貌

2.3 水凝胶流变学分析

4种复合水凝胶的振幅扫描曲线见图5。

由图5可知,4种复合水凝胶在不同频率下的储能模量(G′)和损耗模量(G″)的变化,G′是指黏弹行为的弹性部分,G″是指黏弹行为的黏性部分,若G′＞G″,样品具有类凝胶或固体结构。反之,样品则具有流体结构。

图5 4种复合水凝胶的不同频率下模量变化

振幅扫描测试表明,所有凝胶体在线性黏弹区范围内G′均大于G″,表明所制备出的样品在此频率范围内具有凝胶结构且水凝胶的黏弹行为一直是以弹性行为为主。水凝胶强度由线性黏弹区的G′值确定,凝胶强度与凝胶中氧化海藻酸钠与明胶的交联程度和生物活性玻璃粒径大小有关,海藻酸钠的氧化度均加,与明胶交联程度越大,交联密度增加使凝胶强度越大。在较大变形时,随着BG-1的加入,水凝胶的储能模量增大,这是因为BG-1粒子均匀分散在水凝胶中,起到强化的作用,同时BG-1的加入也提高了交联的密度,使水凝胶的内部网络结构更加完善,抗变形能力增强。在整个振幅范围内,G′始终大于G″,总体呈相互平行的趋势,具有频率稳定性,表明具有稳定的化学交联结构。综上所述,通过流变测试显示,所制备的复合水凝胶均具有良好的交联结构,表现出好的凝胶行为。

2.4 水凝胶自修复性能分析

由于所制备的水凝胶为化学型原位形成的水凝胶,而化学型水凝胶是指在凝胶分子内部引入化学键。由于BG/OSA/Gelatin水凝胶是通过席夫碱反应(化学交联)所制备的,其中形成了动态的亚胺键,当外力使亚胺键断裂时,可以通过再次接触产生新的亚胺键,实现了水凝胶自修复,见图6。

图6 水凝胶自修复过程

由图6可知,BG/OSA/Gelatin水凝胶具有良好的自修复性能。首先,将圆形水凝胶试样切割成两半,其中一半用罗丹明B染色剂将其染成红色,另一半则是水凝胶试样本身的颜色,之后将2个半块水凝胶进行拼接放在25℃恒温恒湿的培养箱中,6 h后观察到水凝胶的拼接处变得模糊,8 h后透明的水凝胶几乎变成红色。24 h后将拼接的水凝胶用镊子夹起并进行轻微的晃动,拼接的水凝胶不会断裂且拼接界面消失,证明了水凝胶的自修复性能。当氧化海藻酸钠与明胶不能发生反应时3种原料也可以通过非共价键作用(物理交联)完成自修复,但氢键的作用力较弱,48 h后的水凝胶通过氢键作用的自修复程度,与BG/OSA/Gelatin水凝胶相比自修复过程较慢,整个水凝胶还未变成红色。

2.5 水凝胶吸水性能分析

水凝胶吸水率见表1。

表1 水凝胶的吸水率

BG/OSA/Gelatin水凝胶无论是在去离子水中还是PBS溶液中经过长时间的浸泡都会达到溶胀平衡。这可能是由于明胶与OSA的结合方式有关,两者通过Schiff反应键合。由表1可知,随着SA的氧化度越大,在与明胶反应时,生成水凝胶的交联度就越大,凝胶网络结构趋于紧密,容纳水的空间变小,所以吸水率变低。而掺杂生物活性玻璃的水凝胶在去离子水和PBS溶液未出现溶解现象,表明掺杂生物活性玻璃的水凝胶有更好的结合强度。这可能与BG中含有钙元素有关,在溶液长时间浸泡时,BG的钙会以Ca2＋的形式溶出,然后与未氧化的海藻酸钠G单元进行离子交联,使水凝胶的交联程度得到增强,形成双交联网络结构的水凝胶,从而不易在溶液中溶解。图4中不同交联程度的复合水凝胶SEM图片也显示出,复合水凝胶随着交联程度降低,网络中的孔会增大。而较大孔结构自然能够吸附更多的水分子,增大材料的吸水率。

2.6 水凝胶力学性能分析

水凝胶的拉伸强度见图7,a为未加入BG且SA氧化度最低时所制备的OSA/Gelatin水凝胶,b为未加入BG且SA氧化度最高时所制备的OSA/Gelatin水凝胶,c为水凝胶1,d为水凝胶2,e为水凝胶3,f为水凝胶4。

由图7可知,水凝胶1和水凝胶2随着OSA的氧化度增大,拉伸强度增大,由86 k Pa增长到168 k Pa,这是由于OSA的氧化度升高,活性醛基量增多,与明胶更容易发生席夫碱反应,从而使水凝胶网络交联更紧密,结构更加稳定,拉伸能力更强。OSA/明胶水凝胶随着BG的掺入,其拉伸强度都比未加入BG的水凝胶拉伸强度高。水凝胶1和水凝胶2的拉伸强度存在较小的差异,是因为BG-1的粒径较小且在制备BG-1时加入聚乙二醇分散剂使颗粒分散的更均匀,在有机相的分布明显更为均匀,而BG-2在水凝胶有机相分布较差,颗粒较大容易团聚影响了水凝胶的网格结构的形成,从而影响了水凝胶的拉伸性能。同理水凝胶3和水凝胶4的现象与结论与此相同。其中,水凝胶3的拉伸性能最好,拉伸强度达到206 k Pa。

图7 水凝胶的拉伸强度

4种水凝胶在轴向方向上进行压缩测试所得的压缩模量见图8。

图8 水凝胶的压缩模量

由图8可知,氧化度增大,使OSA的活性醛基量增多,水凝胶的交联度升高,水凝胶网络交联点之间的链段长度缩短,链段的活动能力减弱,同时分子链之间的作用力加强,因此抵抗外力的能力增强。BG使复合水凝胶的力学性能得到提高,压缩变形量达到90%,水凝胶发生破裂,复合水凝胶的最大压缩强度分别为18.78、16.57、84.37、79 k Pa。当SA的氧化度越高,BG粒径越小时复合水凝胶3的抗压强度最大(84.37 kPa)。复合水凝胶力学性能的提高主要是因为BG颗粒耐压强度较水凝胶高,其本身具有良好的力学性能,因此掺杂BG提高了压缩模量。因为BG-1在溶液中分散较好更易与未氧化的海藻酸钠G单元进行离子交联,使水凝胶的交联程度得到增强,形成双交联网络结构的水凝胶,所以当海藻酸钠的氧化度相同时,掺杂BG-1的水凝胶抗压强度越大。

2.7 水凝胶的降解性能分析

BG、SA都具有良好的生物可降解性,广泛应用于生物医用材料。水凝胶应用于创伤敷料时,若降解速率过快,会导致敷料降解在伤口处,使伤口感染。模拟人体体内生理环境进行体外降解实验,将4种复合水凝胶置于PBS溶液中,进行15 d降解测试,见图9。

图9 水凝胶的体外降解图

由图9可知,随降解时间的延长水凝胶的质量损失逐渐增大。其中水凝胶2的降解速度最快,1 d损失约为总质量的43%,而水凝胶3降解率最低,1 d损失约为总质量的16%,10 d降解速率变慢,在降解15 d后,4种水凝胶的质量损失分别达到79%、74%、61%和58%。这是由于海藻酸钠的氧化度越高,与明胶发生反应时生成水凝胶的交联度就越大,交联度变大增加了分子的空间位阻效应,水凝胶的降解速度变缓。水凝胶1和水凝胶2降解速率也有一些差别,是因为生物活性玻璃的加入,BG中含有钙元素,在溶液长时间浸泡时,BG的钙会以Ca2＋的形式溶出,然后与未氧化的海藻酸钠G单元进行离子交联,使水凝胶的交联程度得到增强,由于BG-1中Ca2＋较多,所以水凝胶1降解速度变缓。同理水凝胶3和水凝胶4也具有相同的情况。

2.8 水凝胶的水蒸气透过率分析

创伤敷料的WVTR过高会导致伤口脱水,而过低的WVTR可引起创面渗出物的积累与覆盖。Lamke等[21]报道了正常皮肤的蒸发失水为(204±12)g/(m2·d),而受伤皮肤的蒸发失水范围从一度烧伤的(279±26)g/(m2·d)到颗粒状伤口的(5138±202)g/(m2·d)。水凝胶水蒸气透过率见图10。

图10 水凝胶的水蒸气透过率

由图10可知,4种复合水凝胶的WVTR测试中,水凝胶3最低,仅为2 563.44 g/(m2·d),水凝胶2最高,可达4 456.29 g/(m2·d)。这表明,复合水凝胶能够保持皮肤水分不会流失过快,具有一定的保湿能力。对比不同复合水凝胶,发现影响WVTR的直接因素是随着氧化剂(高碘酸钠)的量增加,氧化度升高,在与明胶反应时,生成水凝胶的交联度增大,凝胶网络结构趋于紧密,导致复合水凝胶的WVTR降低。间接因素是掺杂的BG中含有钙元素,在溶液长时间浸泡时,BG中的钙会以Ca2＋的形式溶出,然后与未氧化的SA G单元进行离子交联,使水凝胶的交联程度得到增强,形成双交联网络结构的水凝胶,从而导致复合水凝胶的WVTR降低。裸露皮肤的WVTR为4 800 g/(m2·d),而复合水凝胶的WVTR为2 563.44~4 456.29 g/(m2·d),可使人体水分不会通过伤口快速流失,为受伤创面提供一个湿润环境,有助于创伤愈合,且适中的WVTR,还有利于伤口与外界环境进行氧气的交换。综上,复合水凝胶的WVTR较好,在用作伤口敷料可以保证伤口与外界的气体交换,保持创面湿润,促进创伤恢复。