蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株诱导马尾松抗松材线虫病研究

吴佳雯，尹艳楠，谈家金，郝德君

(南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)

松材线虫病又称松树萎蔫病，是世界上极具危险性的林木病害之一[1]，其病原是一种移居性植物内寄生线虫——松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)。松材线虫生长速度快，繁殖力强，主要取食松树薄壁细胞，使树脂分泌停止，导致松树迅速萎蔫直至失水死亡。松材线虫病具有发病快、治理难度大等特点，在许多国家，特别是中国和日本，造成了巨大的经济损失，并威胁着松林生态系统[2]。

马尾松(Pinusmassoniana)作为我国重要的木材和油树脂资源，是感染松材线虫病的主要树种。一些控制措施，如就地药物熏蒸或烧毁，喷洒杀虫剂杀灭媒介天牛等化学防治措施，虽然能延缓松材线虫病的传播速度[3]，但会污染环境，破坏生态平衡，也会使害虫逐渐产生抗药性，导致防治效果逐渐减弱。因此，迫切需要寻求一种安全、有效、无污染的生物防治措施。

许多植物本身就具备抵抗外界伤害能力，能够对多种病害产生抗病能力，即系统抗病性能，属于先天免疫。然而，有些植物当受病原体的原发感染时，需要靠环境中的非生物或生物因子诱导才能激活其防御机制，这种诱导作用可以是多因素的。某些细菌引发植物产生系统抗性称为ISR(ISR induced systemic resistance)现象。植物内生细菌有助于植物适应各种生态系统[4]。植物内生细菌可长期稳定地定殖于植物体，通过自身产生的拮抗物质和酶类，与病原菌竞争营养物质和生态位，灭活病菌萌发因子，降解毒素，诱导寄主植物产生系统抗性ISR及信号传导来阻止病原菌的生长和入侵[5]。一般认为ISR的抗性作用机制与病原体攻击期间植物的超微结构变化和细胞化学改变有关，包括组织木质化增强，产生机械屏障和植保素，细胞壁增厚，改变宿主的生理和代谢反应等。目前植物内生细菌防治植物病害已得到广泛应用[6]。

笔者选用的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)NJSZ-13菌株是南京林业大学松材线虫病防治课题组从湿地松茎部分离得到的1株内生细菌，前期研究结果表明NJSZ-13菌株对松材线虫有较高杀线活性[1]，并且能够在马尾松根、茎等不同部位定殖[7]，本研究将进一步探索该菌株能否诱导马尾松抗松材线虫病，为今后该菌株的研发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马尾松2年生幼苗，江苏沂北园林苗木有限公司提供；蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株[1]和松材线虫强毒虫株AMA3[8]，均由南京林业大学森林病理实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液的制备

用接种环在新鲜蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌落上取1环单菌落接入NB培养基中，置于28 ℃摇床上220 r/min震荡培育48 h后获得发酵液；然后将发酵液在10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，将菌体沉淀用无菌水重悬制成菌悬液[9]。

1.2.2 灭活菌悬液的制备

以1.2.1同种方法制备菌悬液，再使用高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min获得灭活菌悬液。

1.2.3 松材线虫的培养及接种

使用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)对松材线虫AMA3虫株进行培养，于25 ℃恒温箱中培养7 d，再用贝尔曼漏斗法收集线虫液，并将线虫液浓度调至3 000条/mL。

选取长势整齐的马尾松幼苗6株进行处理和12株为对照。灌根法施菌，施菌处理为处理Ⅰ[50 mL浓度为107CFU/mL(CFU/mL指的是每毫升样品中含有的细菌菌落总数)的菌悬液]、处理Ⅱ(50 mL灭活菌悬液)和CK(50 mL无菌水)。4 d后再进行皮接法[10]接种松材线虫处理，施菌的处理Ⅰ和处理Ⅱ分别接1 mL(3 000条/mL)线虫接种液即为处理Ⅲ(处理Ⅰ+1 mL线虫接种液)和处理Ⅳ(处理Ⅱ+1 mL线虫接种液)，CK 1为水接1 mL无菌水(防止因刀切伤口过深导致幼苗死亡)，CK 2为水接1 mL线虫接种液。

1.2.4 病情观察与统计

接种松材线虫后每7 d观察1次马尾松幼苗的发病情况直至CK 2全部死亡。参照谈家金等[11]的方法进行病情分级和病情指数的计算：

病情指数=∑(各病级株树×病级代表值)×100/(总株树×最高病级的代表值)；

防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。

1.2.5 丙二醛含量与防御酶活性的测定

施菌前和施菌6、12、24、48和96 h后，分别取针叶做分析丙二醛(MDA)及防御酶的样品，每处理3个重复，对照6个重复；接种松材线虫前和接种1、7、14、21和28 d后，分别取针叶做分析防御酶的样品，各设3个重复，重复间取样部位基本保持一致。

粗酶液提取采用易龙等[12]的方法，丙二醛含量测定参照李合生[13]的方法；过氧化氢酶(CAT)活性测定参照王学奎等[14]的方法；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚比色法[13]；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑还原法[13]；苯丙氨酸氧化酶(PAL)活性测定参照王学奎等[14]的方法；多酚氧化酶PPO活性测定参照雷东锋等[15]的方法。

2 结果与分析

2.1 NJSZ-13菌株诱导马尾松抗松材线虫病的防治效果

实验结果显示，处理Ⅲ和Ⅳ的马尾松苗首次发病时间分别为接种线虫后21和14 d，而CK 2马尾松苗首次发病时间为接种后第7天，说明NJSZ-13推迟了松材线虫病的发生时间。接种线虫后 42 d，菌悬液处理Ⅲ的松苗发病较轻，部分松苗松针开始褪绿变黄，有的开始枯萎；灭活菌悬液处理Ⅳ的松苗发病较重，部分松苗松针褪绿变黄，有的开始枯萎，也有整株枯死的，松针变红；而无菌水处理的CK 1生长性状正常，接种线虫的CK 2对照发病最重，全部松苗枯死，松针红褐色(图1)。由此可以看出，NJSZ-13菌株延缓了松材线虫病的病情发展。菌悬液处理Ⅲ的防治效果为54%，灭活菌悬液处理Ⅳ的防治效果为33%(表1)。

表1 NJSZ-13菌株对松材线虫病的防治效果

2.2 NJSZ-13菌株处理后马尾松体内MDA含量和CAT活性的变化

NJSZ-13菌株处理后，各处理和对照的马尾松体内丙二醛含量总体都呈先升后降的趋势(图2)。施菌后6 h，各处理和对照的MDA含量达到峰值，随后MDA含量开始下降；施菌96 h后，处理和对照的MDA含量趋于相近。

从不同处理马尾松体内过氧化氢酶活性的变化情况可知，NJSZ-13处理后，在96 h内马尾松CAT 活性均低于对照(CK)，菌悬液处理Ⅰ和灭活菌悬液处理Ⅱ第48 h，马尾松的CAT活性均最低，分别为53.29 U/g和46.35 U/g(图2)，这一结果表明NJSZ-13对马尾松体内CAT有一定的抑制作用。

由接种松材线虫后不同处理马尾松体内丙二醛含量的变化情况(图3)可见：接种松材线虫后，除CK 1接种后28 d的MDA含量恢复到接种前水平，其他所有处理和对照的MDA含量在不同时间均明显增加(图3)。菌悬液处理Ⅲ和灭活菌悬液处理Ⅳ的马尾松体内MDA含量的变化趋势相同，随时间先增加后减少，两种处理MDA含量始终小于接虫CK 2，并且菌悬液处理Ⅲ的马尾松MDA含量始终小于灭活菌悬液处理Ⅳ。接虫CK 2的马尾松体内MDA含量一直处于最高水平。菌悬液处理和灭活菌悬液处理能减少马尾松体内丙二醛的产生，可能是NJSZ-13菌株诱导马尾松抗松材线虫病的机制之一。

接种NJSZ-13菌株后再接种松材线虫，处理Ⅲ、Ⅳ和接虫CK 2马尾松苗体内CAT活性初期较高，后期持续降低，而接种CK 1马尾松CAT活性一直保持最高水平。两种接菌处理的变化趋势相似，其中菌悬液处理Ⅲ的CAT活性始终高于灭活菌悬液处理Ⅳ。接种松材线虫14 d后，两种施菌处理的马尾松体内CAT活性开始高于接虫(CK 2)处理(图3)。

2.3 NJSZ-13菌株处理后马尾松体内POD和PAL活性变化

NJSZ-13菌株处理后，马尾松体内POD活性先升后降，其中前期菌悬液处理Ⅰ较灭活菌悬液处理Ⅱ的POD活性升高较快，后期两种施菌处理的POD活性趋于与CK相近(图4)。表明施菌前处理和CK的马尾松POD活性差异不明显，施菌后12 h，菌悬液处理Ⅰ和灭活菌悬液处理Ⅱ的马尾松POD活性达到最高，分别为406.73和382.81 U/g，而此时CK的POD活性仅为212.48 U/g。

PAL是存在于高等植物中的一种不可缺少的防御酶。试验结果表明NJSZ-13能明显提高马尾松体内PAL活性，并且菌悬液处理Ⅰ和灭活菌悬液处理Ⅱ两者无明显差异(图4)。施菌后，处理和对照的PAL活性均呈先升后降的趋势，施菌处理的PAL活性增加更快。施菌后12 h，菌悬液处理Ⅰ和灭活菌悬液处理Ⅱ的马尾松针叶中PAL活性达到峰值，分别为175.64和182.81 U/g。而对照的PAL活性峰值出现在施菌后24 h，为161.07 U/g。

施菌后再接种松材线虫，马尾松POD活性变化较大(图5)，处理和对照均呈现先升后降的趋势，但两种施菌处理的POD活性始终比未施菌接虫对照高，其中菌悬液处理Ⅲ总体上比灭活菌悬液处理Ⅳ的POD活性高，且两者差异在接种后前期表现明显。接种松材线虫后7 d，菌悬液处理Ⅲ的POD活性达到最高，为777.41 U/g，而灭活菌悬液处理Ⅳ和接虫CK2的POD活性已开始下降，分别降为681.24和473.93 U/g，此时，无菌水CK1的POD活性已超过接虫对照，达到组内最高水平，为543.97 U/g。

仅接种松材线虫CK2的马尾松PAL活性先升后降，病害后期降至CK以下水平。接虫前通过施菌处理，接虫后的马尾松PAL活性增加幅度较大，其中菌悬液处理Ⅲ较灭活菌悬液处理Ⅳ增加尤为明显(图5)。所有接虫株的PAL活性总体上呈现先升后降的趋势，而接无菌水CK2的活性相对稳定。接种松材线虫后7 d，菌悬液处理Ⅲ和接虫CK2的PAL活性达到峰值，分别为387.41和273.93 U/g，而灭活菌悬液处理Ⅳ于接虫后14 d的PAL活性达到峰值，为314.07 U/g。由此可见，NJSZ-13对马尾松体内PAL活性有明显的诱导作用。

2.4 NJSZ-13菌株处理后马尾松体内SOD和PPO活性变化

马尾松体内SOD活性在NJSZ-13菌株处理后，处理和对照的SOD活性含量均呈现先上升后下降的趋势，其中施菌处理的SOD活性升高更快，并且菌悬液处理Ⅰ和灭活菌悬液处理Ⅱ两者间无显著差异。施菌后12 h，灭活菌悬液处理Ⅱ的SOD活性达到峰值，为781.48 U/g，菌悬液处理Ⅰ和CK的SOD活性在施菌后24 h达到峰值，分别为772.76和702.08 U/g。

研究结果显示接种NJSZ-13能提高马尾松PPO活性，其中总体上菌悬液处理Ⅰ较灭活菌悬液处理Ⅱ的效果好。菌悬液处理Ⅰ和灭活菌悬液处理Ⅱ的马尾松在施菌96 h内出现了2个峰值，而对照CK的PPO活性波动也较大(图6)。

但仅接种松材线虫的马尾松SOD活性稍增加后，便急剧下降(图7)。接虫前通过施菌处理，接虫后的马尾松SOD活性增加幅度较大，呈现先升后降的趋势，其中菌悬液处理Ⅲ较灭活菌悬液处理Ⅳ增加尤为明显。而接无菌水对照CK1的SOD活性相对稳定。接种松材线虫后14 d，所有接虫株的SOD活性均达到峰值，菌悬液处理Ⅲ和灭活菌悬液处理Ⅳ的SOD活性分别为1 093.46和892.24 U/g，此时接虫CK2仅769.62 U/g，由此可见，菌株NJSZ-13对马尾松体内SOD活性有明显的诱导作用。

所有接种松材线虫的马尾松PPO活性均为先升后降，而接无菌水对照(CK)马尾松PPO活性相对稳定。仅接种线虫的马尾松CK2 PPO活性于病害后期降至对照以下水平。两个施菌处理Ⅲ的PPO活性均增加，其中通过菌悬液处理Ⅲ的PPO活性后期增加幅度明显，而灭活菌悬液处理Ⅳ的PPO活性变化趋势和接虫对照相近(图7)。接种松材线虫后1d，灭活菌悬液处理Ⅳ和接虫对照CK2的PPO活性达到峰值，分别为285.73和216.13 U/g，而菌悬液处理(Ⅲ)于接虫后7 d的平均PPO活性达到峰值。由此可见，菌株NJSZ-13对马尾松体内PPO活性有诱导作用。

3 讨 论

前期研究表明，蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫有杀线活性[1]，即该菌株本身就对线虫有毒杀和抑制作用。为了进一步证明该菌株是否对马尾松具有诱导抗病的作用，对菌悬液进行灭活处理，以排除细菌自身进入树体内对线虫的杀线作用。结果显示，施用灭活的菌悬液后，马尾松发病速度也有减缓，从而表明该菌具有诱导马尾松抗病因子。Romeiro等[16]证明蜡样芽孢杆菌UFV-101菌株的发酵上清液产生的蛋白类物质能诱导番茄叶片对黄瓜褐斑病(Corynesporacassiicola)的抗性，本研究中发现不管是菌悬液还是灭活的菌悬液，对松材线虫病都具有一定的防治效果，说明本试验中菌株NJSZ-13诱抗因子是非蛋白类物质。而菌悬液的防病效果要好于灭活的菌悬液，可能是由于菌悬液里的菌种在马尾松根部定殖，起到直接抑制和长期诱导相结合的作用，但灭活的菌悬液只能起到短期的诱导作用。说明NJSZ-13可能既能通过其生理活性定殖马尾松体内直接抑制松材线虫的生长，同时又能诱导马尾松防御反应来抵抗松材线虫的侵染。

MDA含量常常可反映植物体内脂质过氧化的程度和细胞损伤的程度，是植物衰老和抗性生理中常用的指标。试验表明接种NJSZ-13菌株能明显降低接虫马尾松体内MDA含量。CAT活性的高低影响到植物体内H2O2的积累水平。H2O2有双重作用，少量的H2O2能激活病程相关蛋白的表达，过多又会对植物细胞造成伤害。隋丽等[17]研究发现，放线菌769的发酵液能够抑制水稻过氧化氢酶活性，对水稻具有诱导抗性。本试验中，施菌处理后马尾松体内CAT活性明显低于无菌水对照，而接虫后期又高于接虫对照，说明菌株NJSZ-13于接虫前期可诱导马尾松产生抗性。

POD可以催化酚类物质的氧化，并参与木质素(木质素具有限制病原菌正常进出细胞，抑制病原菌的生长等作用)的合成，还参与乙烯的生物合成和氧自由基的消除反应。SOD可以调节植物体氧化与抗氧化关系，使它们达到动态平衡，能保护细胞免受超氧阴离子自由基对细胞的损伤。PAL能催化苯丙氨酸的脱氨反应，是苯丙烷代谢的关键酶，其活性与植物抗病性呈正相关，是抗病性的一个生化指标。PPO不仅能催化木质素的合成，构成保护细胞的机械屏障，还能氧化合成对病原菌有毒的醌类物质，抑制病原菌的生长和入侵。经NJSZ-13菌株菌悬液和灭活菌悬液处理后，马尾松体内的这4种酶活性均表现出明显的增加，接种松材线虫后也始终比对照高，说明NJSZ-13菌株能诱导马尾松抗松材线虫病。