PLAG1在结直肠癌中的表达及临床意义

曹路路，吴书胜，闫 滢，柯丽红，罗会芹，陈文菊，胡小秀，李慧敏，牛佳郁，李梦鸽，徐惠君，何义富

根据世界卫生组织国际癌症研究机构报道，2020年全世界结直肠癌(CRC)新发病例约193万例，死亡约93.5万例[1]。尽管CRC的治疗方法在不断改善，但CRC患者的5年生存率仍然很低[2-4]。CRC预后不佳的最关键原因之一是缺乏有效的早期诊断方法[5-6]。大多数患者确诊时已属晚期，无法进行根治性手术。有明确的证据表明，筛查可将CRC发病率和病死率降低30%～60%[7]。此外，尽管手术技术不断进步成熟，但术后复发仍然是临床的难点，因此,寻找能提高诊断率、指导预后的分子靶标是研究热点。

多形性腺瘤基因1(PLAG1)位于人类染色体8q12，属于多形性腺瘤(PLA)基因家族成员之一，大小为7313 bp，包含5个外显子，4个内显子，编码序列为481～1983 nt。PLAG1编码一种具有2个假定的核定位信号的锌指蛋白，由501个氨基酸组成[8]。PLAG1相关基因本体注释包括DNA结合转录因子活性和转录激活因子活性。既往研究表明，PLAG1过表达在软组织肿瘤发生和发展中起到了重要作用[9-10]。近年来，越来越多的研究表明PLAG1是一种促癌因子，如PLAG1为肝细胞肝癌的独立预后因素[11]、PLAG1的敲低能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭及增加卵巢癌细胞化疗敏感性[12]。然而，在不同肿瘤中PLAG1的作用也不完全相同[13]。PLAG1被认为与多种恶性肿瘤的发生、发展和侵袭密切相关。然而，PLAG1在CRC发生发展和预后中的作用仍然不明确。鉴于该领域缺乏足够的研究，我们的研究通过免疫组织化学检测80例CRC患者癌组织和相应癌旁组织中PLAG1的表达情况，并分析了PLAG1的表达与CRC患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料和方法

1.1临床资料和组织标本 收集2014年1月—2017年3月中国科学技术大学附属第一医院西区 安徽省肿瘤医院外科手术切除的CRC患者石蜡标本进行免疫组织化学分析，癌组织和配对癌旁组织(距癌组织≥5 cm)各80例。纳入标准:均接受根治性手术治疗，术前无抗肿瘤治疗史，且组织病理学检查证实为结直肠腺癌;年龄≥18岁;病例资料完整：包括完整的临床病理数据，如年龄、性别、肿瘤分期和分化程度。排除标准:严重的心肝肾功能异常;合并其他部位肿瘤;家族性腺瘤性息肉病或Lynch综合征。根据AJCC第八版进行术后病理分期。根据NCCN指南行术后辅助治疗。采用电话或门诊复查随访获得生存资料，随访截止时间为2022年1月1日，最终获得60例的随访资料。此外，总生存期(OS)定义为手术日期至死亡的时间。无病生存时间(DFS)定义为手术日期至首次明确诊断肿瘤复发或死亡之间的时间。本研究获得了中国科学技术大学附属第一医院西区 安徽省肿瘤医院伦理委员会的批准同意。

1.2免疫组织化学染色 将石蜡包埋的标本切成4 μm厚的切片，将病理切片置于60 ℃的组织干燥箱中60 min。然后切片用二甲苯脱蜡并依次通过梯度乙醇水化，将载玻片在0.01 mmol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)中于100 ℃蒸煮20 min，然后从热源中取出并在缓冲溶液中于室温冷却以进行抗原修复。切片与0.3%过氧化氢一起孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶的活性。将组织载玻片与兔抗人PLAG1多克隆抗体以1∶200的稀释度在4 ℃下孵育过夜，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。并与辣根过氧化物酶耦联的二抗(中杉金桥生物技术，北京，中国)孵育30 min。使用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显色，用苏木精复染细胞核，在梯度乙醇中脱水并用中性胶密封。PLAG1表达的免疫反应强度由2名病理科医师独立评估。我们使用既往文献发表的方法来评估PLAG1的半定量表达，公式如下：免疫反应性评分=染色强度评分×阳性细胞评分的比例。染色强度评分定义为0分(阴性)、1分(弱强度)、2分(中等强度)和3分(强强度)。阳性细胞评分比例定义为0分(无染色)、1分(<25%)、2分(25%～50%)、3分(50%～75%)和4分(≥75%)。切片免疫反应评分≥6分定义为高表达，否则定义为低表达。

1.3生存预后分析 使用GEPIA2数据库(www.gepia2.cancer-pku.cn)分析PLAG1表达与CRC患者OS和DFS间的相关性。操作步骤:输入基因名称PLAG1，点击生存分析页面，选择OS/DFS;选择肿瘤类型CRC(同时选取COAD和READ);点击plot可视化分析。GEPIA2使用Log-rank法进行假设检验。上述线上数据库检索分析时间截至2022年4月27日。将最终获得随访资料的60例CRC根据免疫组织化学PLAG1表达水平评分高低分为2组，使用SPSS 22.0作生存分析并绘制Kaplan-Meier生存曲线。并且将60例CRC的生存信息通过单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析CRC预后相关的危险因素。

1.4基因集富集分析 使用LinkedOmics数据库(http://www.linkedomics.org/admin.php)LinkInterpreter模块进行PLAG1 KEGG聚类分析。具体操作步骤，肿瘤类型:选择CRC;数据类型:选择RNAseq;数据属性:选择PLAG1;靶数据类型:选择RNAseq;统计学方法:选择Spearman相关性分析;导出数据:导出CRC中与PLAG1表达显著相关的前1000位基因;分析:使用DAVID网站进行KEGG聚类分析。

1.5观察指标 ①PLAG1在癌组织和配对癌旁组织中的表达情况；②PLAG1表达与CRC患者临床病理特征的关系；③PLAG1表达与CRC患者预后；④PLAG1在CRC发生发展中可能涉及的分子机制。

2 结果

2.1PLAG1在CRC组织中表达上调 本组80例癌组织和对应癌旁组织免疫组织化学结果显示，PLAG1的阳性表达主要见于CRC组织细胞质中(图1)。CRC组织中PLAG1阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

图1 PLAG1在癌旁组织阴性表达及CRC组织阳性表达情况(HE)

表1 PLAG1蛋白在CRC组织及癌旁组织中的表达情况[例(%)]

2.2CRC组织中PLAG1的表达与T分期和N分期、临床病理分期的关系 PLAG1在CRC组织中的表达与T分期和N分期、临床病理分期密切相关(P<0.05)。但PLAG1水平与年龄、性别、肿瘤类型、肿瘤分化程度间无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 PLAG1表达与CRC临床病理特征关系[例(%)]

2.3PLAG1高表达与CRC患者预后关系及预后影响因素 GEPIA2数据库分析结果显示，PLAG1高表达组CRC患者的OS短于PLAG1低表达组[P=0.0052；HR=1.9，P(HR)=0.0059]。见图2a。PLAG1高表达组的DFS短于PLAG1低表达组[P=0.0070；HR=1.8，P(HR)=0.0078]。见图2b。为了对生存分析数据进行验证，我们进一步通过最终获得随访资料的60例患者的预后数据分析了PLAG1的表达与CRC患者预后的关系。采用Log-rank法进行生存分析，结果显示PLAG1高表达的患者OS和DFS短于PLAG1低表达患者(P<0.05)。见图2c、2d。单因素分析表明，PLAG1表达、N分期和临床病理分期与CRC患者的OS和DFS相关(P<0.05)。见表3。多因素分析显示，PLAG1表达、N分期和临床病理分期是CRC患者术后OS和DFS的独立危险因素(P<0.05,P<0.01)。见表4。

图2 PLAG1与CRC患者预后的关系

表3 CRC术后OS和DFS影响因素的单因素分析

表4 CRC术后OS和DFS影响因素的Cox比例风险回归模型分析

2.4PLAG1在CRC发生发展中可能涉及的分子机制 使用Linkedomics数据库LinkInterpreter模块导出PLAG1在CRC中的KEGG通路富集结果，分析PLAG1在CRC发生发展中的分子功能以及相关分子机制。KEGG通路富集分析结果显示，PLAG1基因可能参与调节WNT、Hedgehog、Notch、Hippo、mTOR、PI3K-Akt等多种信号通路。见图3。

图3 PLAG1在CRC中的功能基因集KEGG通路富集分析PLAG1为多形性腺瘤基因1，CRC为结直肠癌

3 讨论

PLAG1属锌指蛋白家族中的一员，研究发现其在多种肿瘤如腮腺多形性腺瘤、脂母细胞瘤、间质细胞瘤等中异常表达[14-15]。体外实验证实，PLAG1具有促进NIH-3T3细胞增殖、非锚定依赖性生长和使裸鼠成瘤的活性[16]。然而，PLAG1在CRC中的表达和临床意义仍不确定。

本研究通过免疫组织化学检测发现，PLAG1在CRC中的表达水平高于相应的癌旁组织。CRC患者中PLAG1的高表达与不良临床特征显著相关，包括T分期、N分期和临床病理分期。我们的研究结果表明，PLAG1在CRC组织中的表达上调，其高表达可能与肿瘤生长和转移有关，PLAG可能参与CRC的发生与进展。遗憾的是，我们未能在本研究中详细阐述PLAG1在CRC发生和发展中的分子机制。我们通过生物信息学分析推测PLAG1可能参与调节WNT、Hedgehog、Notch、Hippo、mTOR、PI3K-Akt等多种信号通路，亦有研究报道,PLAG1在卵巢癌中参与IGF信号通路调控[12]，在肺癌中参与CamKK2-AMPK信号通路调控[17]，在CRC中的具体分子机制有待进一步研究。

既往研究已经证实，PLAG1在多种恶性肿瘤中如肝母细胞瘤和肌上皮癌中具有评估预后价值[18-20]。PLAG1在多种恶性肿瘤发生发展中也发挥重要作用。在肝细胞肝癌中，抑制PLAG1可显著降低肝癌细胞的增殖和迁移侵袭能力，对于预测肝癌患者肝切除术后的预后具有重要意义[11]；在肾脏透明细胞癌中敲低PLAG1表达在体外能够抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，并在体内能够抑制肿瘤生长[21]；在卵巢癌中，PLAG1与卵巢癌化疗敏感性有关[12]。已有研究发现，PLAG1能够促进微卫星不稳定型CRC的发展和对5-氟尿嘧啶的耐药性[22]，然而在CRC中PLAG1的预后意义尚不十分明确。在本研究中，高表达PLAG1者的OS和DFS短于低表达PLAG1者。此外，我们通过使用Cox比例风险回归模型得出结论，PLAG1表达是CRC患者预后的独立危险因素。

综上所述，PLAG1在CRC中表达上调，其高表达与CRC患者的不良临床特征和较差的预后相关。本研究为PLAG1在CRC中的临床研究提供了理论基础，提出了PLAG1可能作为调控CRC发生发展和预后的一个重要靶点，从而为CRC的诊断、临床治疗和预测预后提供新思路。