仲花茶饮降血糖血脂的生物活性

2022-11-28张锦华刘鑫毅李晓晶白宝清范三红

食品工业 2022年11期

张锦华，刘鑫毅，李晓晶，白宝清，范三红*

1.山西大学生命科学学院（太原 030006）；2.特色植物资源研究与利用山西重点实验室，山西大学（太原 030006）；3.太原生态工程学校（太原 030025）；4.岳康药业集团有限公司（临汾 042500）

目前市场存在很多种类的茶饮料，如：纯茶饮料，包括绿茶、花茶、乌龙茶等；调味茶饮料，如果汁饮料、奶茶饮料等；含汽茶饮料，如碳酸茶饮料；冰茶以及复合茶饮料[1-3]。随着时代的进步，由传统的泡茶手法而得的茶饮料已经不能满足市场的需求，所以目前的企业都纷纷转向了复合型茶饮料市场，通过采用不同原料、不同配比等方法，研发出具有特殊香气、口感以及一定保健功能的新型茶饮料。

岳康药业集团有限公司研发的仲花茶饮，配方以槐花、杜仲叶、炒决明子、黄精、薏苡仁、当归、姜黄、红花为主。槐花具有清肝泻火等功效，现代研究表明，槐花不仅含有人体的必需营养素，还富含多种植物化学成分，有抗氧化、抗炎、降血压、调节免疫等保健功效[4-5]。决明子是豆科决明属植物的干燥成熟种子，能够去火祛湿，清热解毒[6]。是一种药食同源的中药，现代医学研究表明，决明子具有保护肝脏、降压、调血脂和抑菌、抗氧化等作用[7]。薏苡仁是一种常见的中药，其中富含多种人体所需物质[8]，现代药理研究表明，薏苡仁具有降血压、改善糖脂代谢、调节肠道菌群、美白等作用[9]。当归是一种常见中药材，具有改善肠道、补足气血、调节经期的功效[10-11]。姜黄属于姜科植物，具有行气破淤、通经止痛的功效[12]，从姜黄中可提取出姜黄素，姜黄素是一种天然色素，研究表明，姜黄素不仅具有抗癌、抗风湿等功能，还具有改善免疫系统、心血管系统等多种功能[13-14]。桃仁中含有多种活性物质，包括脂肪油类、苷类、蛋白质和氨基酸等[15]，具有改善肠道、除火祛湿、镇咳祛痰等功效[16]。

糖尿病是我国常见的一种慢性疾病，患病率高达10.9%[17]。糖尿病的特征是血糖升高，根据不同的发病原因还分为1型糖尿病与2型糖尿病，患者往往还会患有高血脂，动脉粥样硬化等并发症[18]。糖尿病目前已经是我国居民所面临的主要病症之一，目前的治疗手段仍不能取得较好的效果，需要积极地探索新的治疗方案[19]。最新的研究发现，利用从植物中提取的多酚[20]、多糖[21]等物质，可以对高血糖动物造成显著的降血糖效果。

为了明确该茶饮降糖降脂功效，研究对仲花茶饮的降血糖能力与抗氧化能力进行了测试，证实了仲花茶饮的降血糖功效，为其开发和应用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

仲花茶饮由岳康药业集团有限公司提供。

SPF级昆明小鼠60只（斯贝福生物技术有限公司）；高糖高脂饲料（南京盛民科研动物公司）；基础饲料与饲养环境由中国防护辐射院提供。

链脲佐菌素（STZ）（上海麦克林生化科技有限公司）；盐酸二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司）。

1.2 仪器与设备

三诺血糖仪（三诺生物传感股份有限公司）；酶标仪（美国惠普公司）；石蜡包埋机（Histocentre）；Finesse325石蜡切片机（英国Shandon）；Excelsior全自动组织脱水机（英国Shandon）；BX53荧光显微成像系统（日本Olympus公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 高血糖血脂造模

小鼠经过3 d的适应期后，称重并断食12 h测初始血糖。在60只小鼠中，随机选取10只正常小鼠作为空白对照组，其余全部作为造模试验组。造模组小鼠投喂高糖高脂饲料，禁食不禁水12 h，并注射55 mg/kg STZ（现配现用）诱导小鼠血糖升高。一月后，尾静脉取血测小鼠血糖，小鼠的血糖大于11.1 mmol/L为造模成功。空白对照组（标记为NG）喂养基础饲料，灌胃等量的生理盐水[22]。

1.3.2 试验分组

将50只造模组小鼠随机分为五组，分别是模型组（标记为DM），阳性对照组（标记为MET），低剂量组（标记为ZH-1），中剂量组（标记为ZH-2），高剂量组（标记为ZH-4），低、中、高剂量组分别以100，200和400 mg/kg含量的仲花茶饮进行灌胃，空白组和模型组按200 mg/kg的质量分数灌胃等量的生理盐水，阳性对照组灌胃中剂量200 mg/kg浓度的盐酸二甲双胍。试验结束后水合氯醛麻醉，并脱臼致死[22]。

1.3.3 糖耐量测试

在27 d，小鼠经过12 h禁食后用50%的葡萄糖溶液以2 g/kg对其进行腹腔注射，再经过0，30，60，90和120 min后进行短尾取血，测定血糖值[22]。

1.3.4 体重、血糖及肝脏指数测定

分别在造模后的第7，第14，第21和第28天进行禁食、称重并测血糖，肝脏指数的计算公式见式（1）。

1.3.5 小鼠血脂指标的测定

在28 d后，摘取小鼠眼球，并对眼球取血，再以4 000 r/min转速离心，收集上清液，用试剂盒分别测定小鼠的血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C），低密度脂蛋白（LDL-C）。

1.3.6 小鼠抗氧化指标的测定

在28 d后，摘取小鼠眼球，并立即进行解剖，摘取小鼠肝脏。小鼠肝脏经生理盐水清洗后进行称重，再与生理盐水1∶9混匀均质，将均质后的溶液以3 000 r/min转速离心，收集上清液，分别用试剂盒测提取液中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）的含量[22]。

1.3.7 胰腺组织切片处理

参考文献[23]。切片方法：第28天试验结束时进行肢解，采集样本，取大鼠胰腺，即刻收入10%中性福尔马林液中，固定48 h，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及HE染色，取组织经自来水冲洗固定液，酒精梯度脱水后（70%，80%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ和100%Ⅱ），对组织进行透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ），浸蜡（石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ）后包埋，包埋后的组织3～5 μm切片，经60 ℃烤片后进行H-E染色（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡，过100%Ⅰ，100%Ⅱ，95%Ⅰ，95%Ⅱ，80%和70%的梯度酒精，经苏木素染色、分化、反蓝，伊红染色，过70%，80%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ和100%Ⅱ梯度酒精），最后用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后树胶封片，待镜检。

1.3.8 肠道微生物Alpha多样性分析

无菌环境中收集各组的新鲜粪便，收集到离心管中，液氮冷冻。提取粪便DNA并测序，进行OTU聚类分析、肠道微生物Alpha多样性分析和Beta多样性分析。

1.3.9 数据分析与处理

数据处理使用SPSS 21.0，作图使用Origin 8.5，数据分析使用Statistics。肠道微生物送由诺禾致源公司16s扩增测序。

2 结果与分析

2.1 仲花茶饮对小鼠体重的影响

经观察可知，各组小鼠在适应阶段体重基本一致，而造模后的高血糖小鼠具有毛发无光泽、多食多尿等特征。由图1可知，在整个试验过程中模型组小鼠体重逐渐下降，第4周体重比初始降低了6%，空白对照组小鼠体重不断增大，增长率10%。在灌胃3周时，仲花茶饮剂量组小鼠体重都有明显的升高，高剂量组体重升高了4.4%，中剂量组体重升高了3.3%。从图1中可以明显看到，与空白对照组（NG）和阳性对照组（MET）相比，体重升高的趋势显著降低，表示了仲花茶饮的降体重功能。

图1 仲花茶饮对小鼠体重的影响

2.2 仲花茶饮对小鼠血糖的影响

图2为试验期间仲花茶饮对各组小鼠的血糖值的影响。试验初期各小组小鼠血糖值差异不显著，造模成功后，各组小鼠与空白组的血糖值具有明显差异。灌胃4周时，空白组血糖保持稳定，模型组小鼠血糖显著升高，其余组小鼠血糖均有不同程度降低，高剂量组降血糖效果明显，4周后高剂量组和阳性对照组基本持平，说明仲花茶饮具有良好的降血糖效果。

图2 仲花茶饮对小鼠血糖的影响

2.3 仲花茶饮对小鼠血脂的影响

糖尿病是一种代谢性疾病[24]。这种代谢问题主要是由于脂肪酶的代谢发生问题，导致患者体内TC、TG、LDL-C水平的升高，HDL-C水平的降低[25]。仲花茶饮对小鼠血脂的影响如图3所示。在各模型组小鼠血糖中发现，4种检测指标均与空白对照组存在显著差异，证明在模型组小鼠中存在脂代谢紊乱问题。

图3 仲花茶饮对小鼠血脂的影响

在灌胃不同剂量仲花茶饮的小鼠中，血清TC值与剂量呈反比关系，高剂量组血清TC值与空白对照组无明显差异，与模型组小鼠TC值存在显著差异，说明仲花茶饮具有一定的减少高血糖小鼠体内TC含量的功效，且其降TC含量的能力与给药剂量呈正比关系，其中高剂量组比模型组降低了45.5%，低剂量组比模型组降低了27.49%较阳性对照有所降低；从血糖中TG值分析，模型组小鼠血糖中TG值最高，与空白对照组小鼠TG值存在显著差异。而在各试验组中，仲花茶饮高剂量组优于模型组，低剂量组TG值较模型组降低了27.35%，中剂量和高剂量组TG含量和阳性对照TG含量接近，且比模型组降低了52.75%，说明仲花茶饮具有减少小鼠血清中TG水平、抑制小鼠体内的脂代谢紊乱问题的功效；仲花给药组的HDLC含量明显高于模型组，且空白对照，阳性对照，高剂量组HDLC含量接近，高剂量组比模型组含量高48.25%，效果显著；在给药组中各小鼠的LDL-C值明显低于模型组，且与给药量为反比关系，低剂量较模型组低20.36%，中剂量较模型组低34.51%，高剂量较模型组低51.33%。

2.4 仲花茶饮对小鼠肝氧化损伤的影响

比较常见的抗氧化酶有SOD、CAT、GSH-Px等[26-27]。MDA是一种脂质氧化过程中的副产物，能够反应小鼠的脂肪代谢功能[28]。如图4所示，模型组小鼠的CAT、SOD、GSH-Px水平显著低于空白对照组小鼠，而MDA水平上升显著，说明在模型组小鼠的体能发生了严重的过氧化反应。在对小鼠灌胃仲花茶饮后，小鼠的过氧化反应程度均发生缓解，且SOD、GSH-Px、CAT与给药剂量呈反比关系，MDA与给药剂量呈正比关系，表明仲花茶饮能够抑制高血糖小鼠体内的过氧化反应，提高小鼠的肝脏抗氧化能力，且功效与剂量呈正相关。

图4 仲花茶饮对小鼠抗氧化指标的影响

2.5 仲花茶饮对小鼠胰腺组织的影响

试验结束后，由图5可以看出：正常小鼠的胰岛细胞形态完整、边界清晰，数量较多；模型组小鼠的胰岛内细胞边界不清并且数目有所减少，胰岛细胞受损程度较严重；仲花茶饮给药组的小鼠细胞边界较模型组而言清晰且胰岛内细胞数目对比模型组有所增加，细胞体积有所增大，由此可以推测仲花茶饮可能具有修复损伤的胰岛细胞的作用，进而对糖尿病起到治疗作用。

图5 试验小鼠胰岛组织病理学检查结果

2.6 仲花茶饮对小鼠肠道菌群的影响

韦恩图结果如图6所示。5组重叠部分代表组间共有的OTUs，共409个，而每个组特有的OTU数量则不同，正常组NC有36个，模型组DM有74个，低剂量组ZH.L有346个、中剂量组ZH.M有1 308个，高剂量组ZH.H有358个，说明仲花具有调节糖尿病小鼠肠道微生物作用，且中剂量组效果优于低剂量组和高剂量组；模型组DM、低剂量组ZH.L、中剂量组ZH.M和高剂量组ZH.H与正常组NC单独重合OTU个数分别为：12、84、8和2，说明低剂量组ZH.L与正常组NC的OTU相似度高于模型组DM与正常组NC。

图6 小鼠肠道菌群OUT聚类分析

由表1数据可知，模型组的肠道菌群shanon指数和simpson指数低于正常组，说明经STZ诱导的糖尿病小鼠的肠道菌群多样性降低，与模型组相比，不同给药组均能够提高shanon指数、chao1指数和ACE指数，表明仲花茶饮能够增加糖尿病小鼠肠道菌群的多样性和丰富度。总而言之，患有糖尿病的小鼠其肠道微生物多样性遭到破坏，导致肠道菌群失调，而通过仲花茶饮干预可以一定程度上调节和改善失调的肠道菌群。

表1 Alpha多样性指数分析

图7为所有样本的PCoA分析，由图可以看出PC1的贡献度为40.27%，PC2的贡献度为15.6%，空白组样本和模型组样本分别相对集中在一个单独区域，说明正常小鼠和糖尿病小鼠的群落结构具有差异性。阳性对照组沿着PC1和PC2远离模型组，更接近正常组，且组内中心连接点与正常组中心点的距离小于模型组与正常组的距离，代表肠道菌群结构发生了变化。仲花茶饮组组内个体间虽然不明显聚集，但大都表现出偏离模型组向正常组靠近的趋势，说明仲花茶饮可以调节肠道菌群物种结构组成、减小由STZ诱导的糖尿病小鼠与正常小鼠肠道菌群物种组之间的差异，能改变肠道菌群的分布，改善肠道菌群失调。