响应面法优化牛大力碱溶性多糖的提取工艺

陈建旭，刘艳芬，刘美钿，曾月洁，邓金影

1.广东美味源香料股份有限公司（阳江 529800）；2.鹤山市东古调味食品有限公司（鹤山 529700）

牛大力（Millettia specisoa），俗称山莲藕、血藤、九龙串珠、甜牛大力、牛古大力、大力薯等[1]，为豆科美丽崖豆藤属植物，作为一种药食同源植物在中国南方被广泛种植[2]，主要分布于贵州、湖南、福建、广东、广西、海南等地[3]，其干燥根可入药，性味甘、平，具有强筋活络、补虚润肺等功用，药用历史悠久，临床证明其对多种慢性疾病，如腰痛、腰肌劳损、肾虚带下、风湿性关节炎、慢性肝炎、病后体虚等有治疗作用[4]。牛大力还具有抗氧化和清除自由基、提高免疫、抗疲劳、抗炎、降血糖、平喘、祛痰、镇咳及保肝作用[5-7]。

目前，已有超过50种包括生物碱、黄酮类、苯丙素类、挥发油成分、甾醇类等化合物从牛大力中分离出来[2]，尚未见有关牛大力碱溶性多糖提取的研究报道。因此文章在单因素试验的基础上通过响应面法优化牛大力碱溶性多糖的提取工艺，以期为牛大力资源的开发和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛大力，广东阳西宏伟牛大力产学研产业基地，50 ℃烘箱中干燥，粉碎，过0.25 mm筛备用；无水乙醇、氢氧化钠、苯酚、浓硫酸、盐酸、葡萄糖均分析纯。

1.2 仪器与设备

800Y高速多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；YRE-52A旋转蒸发器、SHZ-D（III）型循环水式真空泵（上海一凯仪器设备有限公司）；SHA-B水浴恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）；DHG-9140A鼓风干燥箱（上海慧泰仪器制造有限公司）；N4S紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；BCE2241-1CCN电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；TDL-4高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 测定方法

多糖含量的测定：苯酚-硫酸法[8]；水分测定：105 ℃恒重法（GB 5009.3—2016）[9]。

1.4 试验方法

1.4.1 牛大力粉的制备

将牛大力置于50 ℃烘箱中干燥，粉碎，过0.85 mm筛，95%乙醇脱脂两次，超声水提，置于50℃烘箱中干燥，粉粹，过0.15 mm筛，得牛大力粉并保存。经测定此牛大力粉水分含量为11.59%。

1.4.2 牛大力碱溶性多糖的提取

准确称取2 g已制备好的牛大力粉，按一定的液料比加入一定质量浓度的NaOH溶液，在一定的温度下提取一定的时间后进行离心，所得滤液置于4 ℃冰箱保存。

1.4.3 牛大力中碱溶性多糖提取率（%）的计算

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

精确称取100 mg 105 ℃干燥恒重的葡萄糖，置100 mL容量瓶中定容。准确吸取20，40，60，80，100，120和140 μL标准溶液，分置于比色管中，各加入蒸馏水使体积为2.0 mL，再各加1.0 mL 5%的苯酚，摇匀，迅速滴加5.0 mL浓硫酸，摇匀后于室温下显色30 min。另取2 mL蒸馏水，同上操作加苯酚和硫酸进行显色反应，作为空白对照。在波长190 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，并计算其标准曲线回归方程。

以葡萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘出标准曲线，如图1所示。得回归方程y=4.955 4x+0.010 9，相关系数R2=0.999 5，具有较好相关性。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 NaOH浓度对牛大力碱溶性多糖提取率的影响

NaOH浓度分别选择2%，3%，4%，5%，6%和7%来进行试验，考察NaOH浓度对牛大力碱溶性多糖提取率的影响，试验条件：温度50 ℃、时间2 h、液料比20∶1（mL/g）、提取次数1次，试验结果见图2。

图2 NaOH浓度对碱溶性多糖提取率的影响

由图2可知，随着NaOH浓度的增加，碱溶性多糖的提取率不断提高，但当NaOH浓度大于5%时，提取率呈现下降的趋势，因此选择NaOH浓度5%作为提取牛大力碱溶性多糖的较适条件。

2.2.2 浸提时间对牛大力碱溶性多糖提取率的影响

浸提时间分别选取0.5，1，2，3，4和5 h来进行浸提，考察时间对碱溶性多糖提取率的影响，试验条件：温度50 ℃、NaOH浓度5%、液料比20∶1（mL/g）、提取次数1次，结果如图3所示。

由图3可知，随着浸提时间的增大，碱溶性多糖提取率也不断提高。但增至2 h后，时间继续增加，提取率出现下降的变化，因此选择浸提时间2 h作为提取牛大力碱溶性多糖的较适条件。

图3 时间对碱溶性多糖提取率的影响

2.2.3 浸提温度对牛大力碱溶性多糖提取率的影响

温度分别选取30，40，50，60，70和80 ℃来进行浸提，考察温度对碱溶性多糖提取率的影响，试验条件：时间2 h、NaOH浓度5%、液料比20∶1（mL/g）、提取次数1次，结果如图4所示。

图4 温度对碱溶性多糖提取率的影响

由图4可知，随着浸提温度的升高，多糖提取率也逐渐增大，但超过60 ℃之后，随着温度的升高，多糖提取率开始缓慢下降，有可能是因为温度过高引起多糖分解等不良影响。因此选择浸提温度60 ℃作为提取牛大力碱溶性多糖的较适条件。

2.2.4 液料比对牛大力碱溶性多糖提取率的影响

液料比分别选取10∶1，20∶1，30∶，40∶1，50∶1和60∶1（mL/g）来进行浸提，考察液料比对碱溶性多糖提取率的影响，试验条件：时间2 h，温度50℃、NaOH浓度5%、提取次数1次，结果如图5所示。

图5 液料比对碱溶性多糖提取的影响

由图5可知，随着液料的增大，碱溶性多糖的提取率也随之增大，但在液料比增至30∶1（mL/g）后，液料比的增加对碱溶性多糖提取率的影响不大，液料比过大还会造成溶剂和能源的浪费，且会给后期浓缩过程带来负担，增加成本，所以选择液料比30∶1（mL/g）作为提取牛大力碱溶性多糖的较适条件。

2.2.5 提取次数对牛大力碱溶性多糖提取率的影响

一次浸提并不能将牛大力中的碱溶性多糖完全提取出来，多次浸提可以提高多糖的得率。将第1次浸提并抽滤至干的牛大力残渣继续进行碱溶性多糖提取，提取条件和第1次浸提的相同，以此类推进行第2，第3，第4，第5和第6次浸提，所得滤液合并，浓缩定容后，分别测定其多糖含量，试验结果如图6所示。

图6 提取次数对碱溶性多糖提取率的影响

由图6可以知道，碱溶性多糖的提取率随着提取次数的增加而增加，二次浸提的多糖提取率显著高于一次浸提的多糖提取率，但三次及之后多次浸提的多糖提取率与二次浸提的多糖提取率没有显著差异，故选用二次浸提作为最终提取方案较为合适。

2.3 响应面试验结果与分析

2.3.1 响应面试验设计及结果

根据单因素试验结果，采用Design-Expert 12的Box-Behnken试验设计原理，以提取温度（X1）、提取时间（X2）、NaOH浓度（X3）、液料比（X4）为自变量，以碱溶性多糖得率（Y）为响应值进行四因素三水平响应面试验设计，将试验数据进行二次回归拟合，得到回归方程。试验因素与水平见表1。

表1 试验因素和水平

用Design-Expert 12软件对表2的结果进行多元回归分析，得到牛大力碱溶性多糖提取率（Y）和提取温度（X1）、时间（X2）、NaOH浓度（X3）、液料比（X4）的编码的二次多项式回归方程：Y=15.44+0.487 5X1+0.630 0X2+0.505 8X3+0.763 3X4+0.937 5X1X2-0.555 0X1X3-0.985 0X1X4+0.540 0X2X3+0.377 5X2X4+0.917 5X3X4-1.63X12-1.84X22-2.03X32-1.25X42。

表2 响应面试验设计和结果

由表3可知，模型的F值为10.34，对应的P＜0.000 1，达到极显著水平，失拟项P=0.168 4＞0.05，不显著，说明方程拟合程度良好，可用于牛大力碱溶性多糖提取工艺参数模型分析。由表3的F值大小顺序可知，各工艺条件对牛大力碱溶性多糖提取率的影响大小顺序为X4＞X2＞X3＞X1，即液料比＞提取时间＞NaOH浓度＞提取温度。方差分析表中各因素显著性分析结果显示：温度（X1）、时间（X2）、NaOH浓度（X3）、液料比（X4）的一次项及二次项均达到显著水平或极显著水平（P＜0.05或P＜0.01）；交互项X1X2、X1X4、X3X4达到显著水平（P＜0.05），其他交互项均不显著。因此可利用此模型进行牛大力碱溶性多糖提取工艺参数的优化分析。剔除不显著项，得到优化后的响应面回归方程：

表3 二次回归模型方差分析

2.3.2 因素交互作用分析

由方差分析表可知，试验所建立的提取数学模型中X1X3、X2X3、X2X4的交互影响较小，X1X2、X1X4、X3X4的交互作用显著，即提取温度和提取时间之间的交互影响对碱溶性多糖提取率有显著影响，提取温度和液料比之间的交互影响对碱溶性多糖提取率有显著影响，NaOH浓度和液料比之间的交互影响对碱溶性多糖提取率有显著影响，它们交互作用响应曲面分别如图7～图9所示。

图7 温度和时间交互作用影响

图9 NaOH浓度和液料比交互作用影响

从图7可以看出：当提取时间一定时，提取温度在50～70 ℃之间变化，碱溶性多糖的提取率先是显著增大，但到达一定值时，又开始慢慢减小；当提取温度一定时，提取时间在1～3 h之间变化，碱溶性多糖的提取率先是逐渐增大，到达一定值时，又开始慢慢变小。

从图8可知：当提取温度一定时，液料比在20∶1～40∶1（mL/g）之间变化，碱溶性多糖的提取率先是显著增大，但到达35∶1（mL/g）左右时，变化趋于平缓；当液料比一定时，提取温度在50～70 ℃之间变化，碱溶性多糖的提取率先是逐渐增大，到达一定值时，提取率缓慢变小。

图8 温度和液料比交互作用影响

从图9可以看出：当液料比一定时，NaOH浓度在4%～6%之间变化，碱溶性多糖的提取率先是显著增大，但到达5%左右时，又开始明显减小；当NaOH浓度一定时，液料比在20∶1～40∶1（mL/g）之间变化，碱溶性多糖的提取率先是逐渐增大，到达一定值时，又开始慢慢变小。

2.3.3 响应面试验模型的验证

经Box-Behnken试验设计，Design-Expert 12软件对试验数据进行分析处理后，得到牛大力碱溶性多糖提取的最优工艺参数：提取温度60.595 ℃，提取时间2.264 h，NaOH浓度5.245%，液料比34.124∶1（mL/g），预测的牛大力碱溶性多糖为15.759%。结合实际操作的可行性，将最佳工艺参数修正为提取温度61 ℃，提取时间2.3 h（138 min），NaOH浓度5.2%，液料比34∶1（mL/g），在此条件下进行牛大力碱溶性多糖提取的验证试验，做3份平行试样，结果如表4所示。

表4 最优提取条件下牛大力碱溶性多糖的提取率

由表4可知，在此条件下牛大力碱溶性多糖的提取率为15.91%，与模型预测值基本符合。

3 结论

根据单因素试验结果，采用Design-Expert 12的Box-Behnken（BBD）中心组合原理设计响应面试验以及响应面分析，建立以提取温度（X1）、提取时间（X2）、NaOH浓度（X3）、液料比（X4）为自变量，以碱溶性多糖得率（Y）为响应值的多元二次回归数学模型。经方差分析和可信度分析，回归决定系数为0.911 8，回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项（P=0.168 4＞0.05）不显著，根据优化的工艺参数进行验证试验，选择提取温度61 ℃、提取时间2.3 h（138 min）、NaOH浓度5.2%、液料比34∶1（mL/g），此时牛大力碱溶性多糖的提取率为15.91%，与预测值基本相符，说明采用响应面法建立的牛大力碱溶性多糖提取工艺稳定可行，可用于牛大力碱溶性多糖的提取。