酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽工艺

张国玉，俞存兵，余奕珂，李宣延

辽渔集团有限公司（大连 116113）

我国是一个渔业大国，渔业资源极为丰富。近些年随着我国远洋渔业的快速发展，鱿鱼产量逐年增加，鱿鱼在加工过程中，产生大量鱿鱼皮和鱿鱼内脏的废弃物。只有少量工厂将其加工为低值水产饲料，大部分工厂均采用掩埋丢弃等方法[1]，造成资源的极大浪费。实际上，鱿鱼皮中含有大量蛋白质，其中含量最多的是胶原蛋白，因此鱿鱼皮可作为一种新型的胶原蛋白资源[2]。

现代科学研究证实，海洋生物蛋白质经水解后得到的海洋生物活性肽有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等活性[3]，在医药、保健品和化妆品等高附加值领域得到应用[4-5]。此外，海洋动物蛋白在酶解、低抗原性、低过敏性等方面要优于陆地动物蛋白[6-8]。许庆龄等[9]开展热水提取法、酶解提取法等制备鱿鱼皮胶原蛋白的工艺研究。林燕等[10]研究发现利用鱿鱼皮提取的胶原蛋白肽具有良好的生产加工性能，其抗氧化性、溶解性、泡沫稳定性等较为稳定，在食品、功能食品和化妆品领域应用前景广泛。试验以秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）加工废弃物鱿鱼皮为原料，选取一种合适酶，优化酶解条件，并确立鱿鱼皮胶原蛋白肽制备工艺，为鱿鱼皮的高附加值利用提供理论依据，对于鱿鱼资源的综合利用有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

秘鲁鱿鱼皮（辽渔集团鱼品加工厂）；胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、alcalase蛋白酶（大连联合博泰生物技术有限公司）；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

LX-B50型立式压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）；GL-21M高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；UV759CRT紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；FD-1B-50型冷冻干燥机（北京博医康实验室仪器有限公司）。

1.3 工艺流程

秘鲁鱿鱼皮→原料预处理→热水提取胶原蛋白→酶解→灭酶→离心分离→真空浓缩→冷冻干燥→胶原蛋白肽粉

1.4 试验方法

取一定量的秘鲁鱿鱼皮，解冻后清洗，将鱿鱼皮剪成小块后，分别用一定浓度的NaOH溶液和硫酸溶液浸泡，水洗至中性，匀浆后热水提取胶原蛋白，调节胶原蛋白溶液pH，加入一定量的酶，恒温酶解，水解结束后灭酶离心得到酶解液，酶解液经真空浓缩冻干得到胶原蛋白肽粉。

1.5 测定指标及分析方法

水分：按GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定；灰分：按GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》测定；总蛋白：按GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》测定；总脂：按GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》测定；总糖：按GB/T 9695.31—2018《肉制品 总糖含量的测定》测定；羟脯氨酸：按GB/T 9695.23—2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》测定。

肽及氨基酸：称取样品，加入三氯乙酸溶液，混合均匀，静置10 min，离心取上清液，按GB/T 5009.5测定总蛋白含量。

2 结果与讨论

2.1 水解用酶的确定

选择胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、alcalase蛋白酶为水解酶，分别在最适条件下酶解，以肽及氨基酸含量和得率作为评价指标，结果见表1。胃蛋白酶水解后肽及氨基酸含量和得率均较低，木瓜蛋白酶和alcalase蛋白酶水解后得率偏低，而中性蛋白酶和胰蛋白酶水解后肽及氨基酸含量和得率均较高，考虑到酶价格及能耗因素，选择中性蛋白酶作为水解用酶。

表1 各种酶水解效果的比较

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对酶解效果的影响

鱿鱼皮经前处理后，分别按料液比1∶2，1∶4，1∶6，1∶8和1∶10（kg/L）提取胶原蛋白，提取后酶解得到胶原蛋白肽粉，以得率为评价指标，结果见图1。随着液体占比增加，中性蛋白酶酶解作用充分，得率随之升高，但液体占比过大时，酶浓度降低，导致得率下降，料液比1∶6（kg/L）时得率最高，因此选取1∶6（kg/L）为最佳料液比。

图1 不同料液比对得率的影响

2.2.2 不同加酶量对酶解效果的影响

鱿鱼皮经前处理后，按料液比1∶6（kg/L）加水提取胶原蛋白，加酶量分别为600，1 200，1 800，2 400和3 000 U/g，酶解后得到胶原蛋白肽粉，以得率为评价指标，结果见图2。随着加酶量增加，酶浓度增加，得率也随之提高，但得率相差不大，考虑到成本因素，加酶量选择600 U/g。

图2 不同加酶量对得率的影响

2.2.3 不同酶解时间对酶解效果的影响

鱿鱼皮经前处理后，按料液比1∶6（kg/L）提取胶原蛋白，酶解时间分别为2，3，4，6，8，16和24 h，以得率为评价指标，结果见图3。随着酶解时间延长，得率逐渐提高，后期趋向平稳，虽然总体结果差异较小，但酶解时间短会导致得到的肽粉中肽段多属于大分子肽链，不利于人体吸收，因此酶解时间选择6 h。

图3 不同酶解时间对得率的影响

2.3 正交试验

将料液比固定为1∶6（kg/L），选取加酶量、温度、pH和时间4个因素，以得率和肽及氨基酸含量为评价指标，进行四因素三水平正交试验，见表2。

表2 正交试验因素与水平表

正交试验结果见表3。肽及氨基酸含量结果差异较小，因此选择得率作为正交试验评价指标，极差分析显示，各因素对得率影响结果为D＞B＞A＞C，最佳酶解工艺为A2B1C1D2，即加酶量600 U/g、温度45℃、pH 6.0、酶解时间4 h。

表3 正交试验结果表

2.4 胶原蛋白肽粉营养成分分析

将秘鲁鱿鱼皮经前处理后，按优化后确定的酶解工艺得到胶原蛋白肽粉。其感官评价和营养成分分析结果分别见表4和表5。

由表4可知，该肽粉呈淡黄色粉末状，具有该产品特有的气味，无其他异味，符合胶原蛋白肽粉的行业标准要求。由表5可知，该肽粉高蛋白且低脂低糖，营养价值较高，肽粉中的羟脯氨酸含量较高，说明肽粉总蛋白中胶原蛋白肽比例较高，达到胶原蛋白肽粉的行业标准要求。

表4 鱿鱼皮胶原蛋白肽粉感官指标

表5 鱿鱼皮胶原蛋白肽粉营养成分 单位：%

3 结论

从5种蛋白酶中筛选中性蛋白酶作为鱿鱼皮水解用酶，通过单因素试验确定热水提取胶原蛋白的料液比，通过正交试验进一步优化酶解条件，最终确定酶解条件：加酶量600 U/g、温度45 ℃、pH 6.0、酶解时间4 h。在此酶解工艺条件下得到的肽粉呈淡黄色粉末状，是一种低脂、低糖、高蛋白的肽粉，营养价值较高，初步达到胶原蛋白肽粉的行业标准要求。

在此酶解工艺下得到的鱿鱼皮胶原蛋白肽粉虽蛋白含量较高，但其中肽段分子量大小不均一，且灰分较高，因此在后续工艺优化中考虑将鱿鱼皮胶原蛋白肽酶解液过不同分子量的超滤膜，从而实现不同分子量的胶原蛋白肽段的梯级分离，同时可降低灰分比重，得到功效更好的产品。