低能量高频振动对骨组织细胞及骨愈合的作用及机制研究进展

王佳明，郑蹦蹦，马勇胜

(哈尔滨医科大学附属第一医院骨二科，哈尔滨 150001)

骨对机械性振动刺激敏感，可通过调节骨骼的质量和结构应对不断变化的负荷。骨细胞是骨组织中主要的机械刺激感觉细胞[1]，振动刺激可通过激活分子信号通路调节骨软骨细胞和成骨细胞的增殖、分化和基质产生。骨组织在低应力条件下由间充质细胞生成，而间充质细胞在高应力条件下可形成纤维组织，在中等应力下，间充质细胞分化为软骨细胞，并启动软骨性愈伤组织的形成，这一过程最初填补了骨折空隙[2-3]。因此，生物力学环境在骨重建和骨再生过程中对骨细胞的影响至关重要。此外，在骨植入物整合过程中，生物力学环境也起着至关重要的作用。植入物材料的表面特性及其生物力学特性是影响成骨细胞向植入物表面募集和分化的主要因素，可防止植入物的松动。因此，开发新型的骨科植入物材料和涂层成为研究热点。目前，骨科植入物多为不锈钢、钛合金，其作为人体内异物会引起局部的炎症反应，而镀有二氧化钛/钛酸镁(TiO2/Mg2TiO4)纳米层的骨植入物能够很好地解决植入物分层的问题[4]，镁合金植入引起的术区炎症反应程度低于其他植入物，且具有较高的机械强度和弹性模量，故较钛合金和不锈钢合金更适合作为骨折手术内植入物[5-6]。骨具有机械敏感性，低能量高频振动(low-magnitude high-frequency vibration，LMHFV)可促进骨质疏松患者的骨形成、改善其骨密度[7-8]，故认为LMHFV对于改善骨愈合和骨植入物骨整合有积极影响。现就LMHFV对骨组织细胞及骨愈合的作用及机制研究进展予以综述。

1 LMHFV对骨组织细胞的作用

在骨折愈合过程中，LMHFV对不同骨组织细胞类型产生不同的影响。LMHFV可诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)骨架重构，从而影响MSC的增殖和分化；还可通过减少成骨细胞释放破骨细胞介质来直接或间接抑制破骨细胞的形成和活性。LMHFV可调节巨噬细胞极化、促进血管生成、增加骨折处的骨形成，故分析LMHFV在细胞层面上的骨愈合相关信号通路和机制有重要意义。

1.1LMHFV与骨髓MSC(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC) BMSC是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的基质细胞[9]，存在于中轴骨或外周骨松质骨的骨小梁中，骨髓组织中含量最多，可分化为骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪等[10]。骨折发生时，BMSC在体内多种炎症因子、免疫调节因子等细胞因子作用下定向迁移、分化[11]，并在骨折部位完成归巢及植入[12]。BMSC通过分泌表达多种细胞因子(如转化生长因子、骨形态发生蛋白)促进骨与软骨的形成[13]，在骨折部位的招募过程中发挥重要作用。LMHFV可在细胞水平上抑制干扰素产生，并可抑制自然杀伤细胞和T细胞的活化、增殖及细胞毒性作用[14]。

骨折发生时受损组织导致的局部出血和缺氧会造成炎症反应，产生白细胞介素-6等炎症因子，这些炎症因子会刺激骨髓释放MSC，并促进骨折部位MSC的归巢[15]，从而促进骨愈合。LMHFV通过刺激基质细胞衍生因子-1/CXC趋化因子受体4通路促进骨折愈合，对MSC的募集起重要作用，故血清基质细胞衍生因子-1检测可评估LMHFV对BMSC的募集作用程度[16]，从而调整LMHFV的能量和频率参数，体现了LMHFV的可调节性。此外，LMHFV可通过抑制脂肪生成和促进成骨作用来改变BMSC的谱系定型[17]，促进BMSC增殖[18]。其中，LMHFV对BMSC的机械转导主要通过细胞骨架重构机制来完成[19]。其具体过程为LMHFV通过上调肌动蛋白相关基因，并通过细胞核与细胞骨架的偶联放大机械刺激反应进一步促进细胞信号转导[20]。

1.2LMHFV与成骨细胞 骨的形成由成骨细胞介导，其中机械刺激对成骨和骨重建具有至关重要的作用。骨细胞[21]和成骨细胞[22]是机械敏感细胞，成骨细胞可受到LMHFV的影响。当振动范围为0.25～0.5 g、振动频率为30～60 Hz时，细胞发生增殖、矿化，细胞骨架染色结果显示，LMHFV可增加细胞外基质的矿化作用[23]。此外，LMHFV可加速成骨细胞的分化。LMHFV还可显著提高血清碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白/成骨相关转录因子抗体/Ⅰ型胶原蛋白和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表达，而下调骨硬化蛋白(sclerosteosis，SOST)基因表达[24]，上述标志物对骨形成和成骨细胞分化非常重要。此外，LMHFV可明显上调低密度脂蛋白受体相关蛋白6和β联蛋白信号通路成员Wnt3a、低密度脂蛋白受体相关蛋白6、β联蛋白的基因表达[25]，其对成骨细胞生成均具有积极影响。

机械性振动刺激可促进成骨相关基因表达，并降低破骨细胞的表达。外部生物力学刺激与调节MSC中肌动蛋白的细胞骨架重构有关，Haffner-Luntzer等[26]研究表明，LMHFV可增加肌动蛋白重构，振动组的微丝数量增加、应力纤维变厚，表明振动诱导的成骨细胞效应可能取决于细胞骨架的重排。此外，骨组织中的机械转导主要取决于雌激素及雌激素受体(estrogen receptor，ER)[27]，特别是LMFHV中ERα对成骨细胞的作用。环加氧酶2受LMHFV机械应变上调，并参与成骨细胞增殖。综上，LMHFV可通过上调与成骨细胞分化相关蛋白的mRNA转录、Wnt相关基因表达、低密度脂蛋白受体相关蛋白6、β联蛋白的基因表达以及细胞骨架重构和ER通路来调节成骨细胞的增殖、分化及基质矿化，从而促进骨愈合。

1.3LMHFV与破骨细胞 除上调成骨细胞对破骨细胞生成的间接作用外，LMHFV还可能直接作用于破骨细胞。这些细胞来自单核细胞/巨噬细胞的造血谱系，对骨吸收至关重要。破骨细胞的分化和活性由核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)结合诱导，但该作用可被可溶的RANKL结合受体OPG减弱[28]。Wu等[29]对小鼠RAW246.7破骨细胞进行45 Hz(0.3 g)的LMHFV处理(15 min/d)，分析抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)阳性的多核细胞和破骨细胞特异性基因表达，结果表明，机械性振动刺激能够显著下调TRAP阳性多核细胞的形成和破骨细胞基因组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9的生成。TRAP和组织蛋白酶具有骨骼吸收作用，基质金属蛋白酶9可介导前体细胞向骨骼迁移，而LMHFV可减少破骨细胞黏附结构中肌动蛋白环的形成[30]。Sakamoto等[31]研究发现，在破骨细胞和骨细胞培养板底部行机械性振动刺激后，破骨细胞的分化明显增加，其原因可能为振动刺激导致骨细胞上清液中RANKL/OPG比值升高。由此可见，LMHFV可影响破骨细胞功能、抑制破骨细胞增殖，但其对骨骼重构过程中破骨细胞的潜在机制仍需要进一步探索。

1.4LMHFV与骨细胞 骨细胞源自成骨细胞，可嵌入矿化的骨基质中，并通过调节成骨细胞和破骨细胞活性来调节骨骼重构。此外，骨细胞可分泌促进或抑制骨形成或吸收的细胞因子，通过树突突触与周围细胞进行信号传递。骨细胞被认为是骨组织中的主要生理机械传感器，可受LMHFV的影响。Thompson等[32]将LMHFV应用于源自BMSC衍生的骨细胞，未发现骨细胞标记基因牙本质基质蛋白1、成纤维细胞生长因子23的变化，表明LMHFV对骨细胞的分化或矿化没有影响。然而，LMHFV可明显降低SOST mRNA的表达，但RANKL和OPG不受影响。SOST是成骨细胞骨形成的抑制剂，可增加成骨细胞的骨形成。Sakamoto等[31]发现，在振动刺激下，MLO-Y4细胞的RANKL mRNA表达增强，而OPG水平不受影响，表明LMHFV对破骨细胞分化具有间接的积极作用。在分子水平上，间隙连接细胞间通讯可能通过连接蛋白43参与振动诱导的细胞机械转导[33]。综上，LMHFV可激活RANKL表达并减少骨细胞中SOST，但不直接影响骨细胞分化标记基因。

2 LMHFV对骨再生的作用

骨折发生后的骨再生需要多种不同细胞类型和生物介质之间的复杂相互作用。适当机械性振动刺激对于骨折愈合十分重要，通过LMHFV引入外部机械刺激可对骨形成产生积极影响。骨折发生时，局部炎症反应受到促炎介质肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1和白细胞介素-6以及抗炎介质白细胞介素-10的调节[34]。在去势骨质疏松动物模型中，LMHFV影响大鼠骨折愈合过程中的早期炎症反应，骨质疏松大鼠先天免疫的相对稳定性有所变化[35]，但关于振动刺激作用下炎症反应程度变化的认识尚未达成共识[36]，仍需进一步探究。同时，LMHFV被认为可能是影响骨折愈合效果的重要机制。既往研究证实，M2型巨噬细胞可促进祖细胞的成骨分化[37]。骨折早期M1型巨噬细胞较多，而M2型巨噬细胞较少。Chow等[35]发现，LMHFV可促进骨折早期再生性M2型巨噬细胞的产生，表明振动刺激与巨噬细胞极化表型的改变有关。

骨折愈伤组织中，新血管的形成对骨再生十分重要。骨折部位的血液供应减少导致动物模型和患者的骨愈合效果不佳[38]。由于骨折后纤维愈伤组织的正常形成与骨折愈合结局高度相关，且在很大程度上受到骨折部位生物力学环境的影响，因此LMHFV施加机械刺激可能促进骨折愈合。有研究表明，LMHFV可加速生理性骨折愈合，并能够进一步挽救去卵巢诱导的骨质疏松性骨折受损愈合[39]。机械性振动刺激在骨折后1～3周通过增加愈伤组织的宽度和面积来促进愈伤组织的形成[40]。但LMHFV仅可改善去卵巢动物的骨折愈合，而其作用于雌激素正常分泌小鼠则表现为骨折愈合延迟[41]。在雌激素缺乏小鼠中，LMHFV(45 Hz、0.3 g)可显著增加骨折部位矿化骨痂的体积，促进骨形成[42]，可见雌激素在介导LMHFV骨吸收的作用中起着至关重要的作用。在分子水平上，ER的表达可能在振动生物力学诱导的骨折加速愈合中起重要作用。在去卵巢大鼠的骨折中，LMHFV可增强mRNA水平以及蛋白水平上ERα的表达[40]，故推测ERα具有机械刺激感觉功能。

在振动频率方面，比较间歇性和连续性振动的疗效显示，LMHFV作用于7 d间隔组实验动物骨折部位的愈伤组织形成面积最大，骨折愈合效果最佳[43-44]。由此可见，LMHFV可能通过影响骨折部位的局部炎症反应、巨噬细胞极化表型促进纤维愈伤组织形成，进而促进骨再生，加速骨折愈合。

3 LMHFV对骨植入物的整合作用

复杂多样的骨创伤类型推动了骨修复材料及相关材料的飞速发展。随着材料学的发展，合金被制成有微孔隙植入物，其可与周围骨骼更好地结合，并促进合金之间的骨骼生长，且不易发生松动。使用3D打印的钛合金骨小梁杯治疗骨质疏松且初次全髋关节置换的患者，结果显示，与钽杯组相比，钛杯组的初始稳定性及骨长入效果更佳[45]。另有研究显示，结合3D打印技术个性化定制钛合金假体能够成功为患者重建长达11.7 cm的股骨骨缺损[46]。在椎体压缩性骨折方面，与单纯经皮椎体成形术治疗组相比，3D打印辅助经皮椎体成形术治疗组的椎体高度恢复率和骨水泥单侧分布率均较高，且骨水泥渗漏发生率较低[47]。骨植入物骨整合是防止骨再生过程中植入物失败的关键，植入物材料及其表面特性可能影响成骨细胞向植入物表面募集和分化，是避免植入物松动的主要因素。

外部生物力学刺激可能是优化骨整合的一种良好选择，其骨合成代谢潜力已充分得到证明，骨-植入物界面的机械条件对骨再生和骨整合至关重要[48]。研究显示，经LMHFV干预的植入物周围的骨形成明显增加[49]。此外，LMHFV的应用使骨-植入物界面的骨矿物质密度明显升高，且其作用可通过生物力学测试进一步加强[50]。LMHFV不仅可直接促进植入物与周围骨组织的紧密接触，还可在骨折愈合过程中，协同植入物与骨组织剪切力和骨折部位已形成的新骨共同促进植入物骨整合[51]。LMHFV或阿仑膦酸盐均可明显提高去卵巢大鼠的骨整合，与阿仑膦酸盐相比，LMHFV的作用较小，故认为LMHFV和抗骨质疏松药物可能对植入物的骨整合有附加作用[52]。

在接受LMHFV治疗的动物模型中，成骨相关基因Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2和OPG均上调，表明LMHFV可促进成骨细胞和矿化[53]。在LMHFV作用下，骨合成代谢的经典Wnt/β联蛋白通路中的β联蛋白、Runt相关转录因子2表达明显升高，而SOST蛋白表达明显降低[54]。此外，RANKL mRNA水平显著降低，其与破骨细胞的活性和分化与RANKL诱导结合有关[55]，故认为LMHFV可激活成骨细胞并抑制破骨细胞途径，而骨植入物周围由机械性振动刺激引起的骨形成机制仍需进一步研究。综上所述，LMHFV通过促进成骨细胞生成和抗骨吸收作用改善雌激素和缺乏动物模型中钛植入物的骨整合。

4 小 结

机械刺激被认为是骨骼重构和再生中必不可少的调节器。在细胞分子学方面，机械刺激能够增强MSC和成骨细胞的增殖和成骨分化，ER信号转导尤其在成骨细胞中起关键作用，Wnt/β联蛋白信号转导通路是介导LMHFV影响的重要机械敏感途径。LMHFV还可诱导细胞骨架重构，这可能影响MSC的增殖和分化。LMHFV可能是改善骨愈合和植入物整合过程的一种有前景的治疗策略。LMHFV的临床应用需要充分认识其分子机制、不良反应及对患者的潜在益处，且其促进骨折愈合的作用、治疗方案和安全性需要更多临床研究的证实。可见，未来仍需不断探索不同生物力学刺激模式对不同队列患者的精确和可控治疗。