胰岛与干细胞共移植治疗糖尿病中干细胞来源与作用机制的研究进展

孙平，吴航飞，程颖（中国医科大学附属第一医院器官移植暨肝胆外科，辽宁 沈阳110002）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是我国发病率较高的慢性进展性疾病，终生注射外源性胰岛素是目前数千万糖尿病患者维持生命的主要治疗方法。然而，胰岛素注射并不能逆转β 细胞损伤、改善胰岛素抵抗，也无法治愈全身各大脏器微血管病变并发症，还有可能导致低血糖。近年来，将干细胞作为“治疗药物”在胰岛移植领域中取得了巨大研究进展，弥补了单纯胰岛移植存活期短、仍需补充外源性胰岛素等不足，且避免了相关并发症的发生发展，从而保护肾脏、心脏等重要器官，提高患者生活质量。本文主要从不同类型干细胞与胰岛共培养辅助治疗糖尿病的方法机制、优势短板以及研究进展进行综述，希望对研究糖尿病的治疗方法尤其是胰岛与干细胞共移植、应用干细胞移植技术恢复胰岛功能提供一定参考。

1 DM 简介及其常规治疗

DM 是一种受遗传、环境、生活习惯等多因素影响的以高血糖为特征的慢性进展性代谢性疾病，是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗所致。患病早期可通过口服降血糖药物或注射胰岛素等将血糖维持在正常范围内，晚期胰岛β 细胞严重损伤并出现功能衰竭以及长期碳水化合物、蛋白质和脂肪等代谢紊乱，可引起多系统损害，导致脑、心、肾、视网膜等出现继发性并发症，病情严重或应激时也可发生严重的急性代谢紊乱，如糖尿病酮症酸中毒、高渗高血糖综合征［1］。根据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF）的数据，2015 年全世界约有4.15 亿年龄在20 ～79 岁的成年人患有糖尿病，预计到2040 年，这一数字将再增加2 亿，因而糖尿病被认为是全球公共卫生负担之一［2］。按照美国糖尿病学会（American Diabetes Association，ADA）分型方法，糖尿病主要分为1 型糖尿病、2 型糖尿病、妊娠期糖尿病以及特殊类型糖尿病。目前，中国治疗糖尿病的常用药物为双胍类、磺脲类、格列奈类、α-糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类药物和胰岛素，除上述常用药物外还包括其他新型降糖药物，如二肽激肽酶Ⅳ抑制剂、钠-葡萄糖共转运蛋白2 抑制剂、胰高血糖素样肽-1 受体激动剂等。但是糖尿病现阶段治疗仍受到终身用药或终身注射外源性胰岛素以及低血糖症等风险的限制，并且大部分降糖药物对肝、肾、消化道等具有很强的不良反应，且降糖药物也不能阻止心、脑、肾、血管等相关的中晚期并发症的发生发展。因而β 细胞替代治疗法从中脱颖而出，其不但没有传统药物的缺点，还具有重建患者血糖调节系统的能力，具有广阔的应用前景。现对于β 细胞替代治疗法的研究多采用干细胞移植，因为用于移植的功能性干细胞可以逆转胰岛细胞的损伤，促进胰岛细胞的再生，进而恢复并改善胰岛细胞的功能，重建血糖代谢以达到较好的治疗糖尿病的效果，因此干细胞移植是一种极具前景的糖尿病治疗方法［3］。干细胞治疗2 型糖尿病及其并发症临床试验的信息约76 项，在中国、印度、美国等国家已进入1 期/2 期临床试验阶段，其中包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞［4］。但目前大多数干细胞对糖尿病治疗的研究还处于实验动物水平，其中包括人胎盘间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、诱导性多能干细胞、人胆囊上皮干细胞、人脱落乳牙牙髓干细胞等。近年来，随着细胞替代疗法的不断发展，这些具有潜力的细胞为糖尿病细胞治疗提供了无限的可能。本文将针对这些细胞的实验进展及应用前景进行综述，主要围绕间充质干细胞进行展开论述。

2 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治疗

MSCs 又称基质细胞或间充质祖细胞，来源于中胚层、具有多向分化潜能和较强自我更新能力的非造血组织干细胞［5］。MSCs 获取途径多样，获取方法及培养技术简单，被广泛应用于各个领域。越来越多的证据表明，MSCs 移植可以促进胰岛移植物再血管化，对胰岛移植物具有营养作用，也可以发挥免疫调节及调控内质网应激的作用，从而改善胰岛移植效果［6］，这为临床治疗DM 提供胰岛与干细胞共移植的新思路。

2.1 骨髓间充质干细胞 （bone marrow derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs）治疗：BM-MSCs 是最早发现的间充质干细胞，其具有很强的分化和复制能力，具有较好的免疫调节能力、辅助造血能力、修复能力，是极具应用前景的干细胞之一［7-8］。21 世纪初，Xie 等［9］成功将人BM-MSCs 在体外诱导分化为胰岛素分泌细胞（insulin-producing cells，IPCs），这些IPCs 表达与胰岛β 细胞发育及功能相关的多个基因，包括葡萄糖转运蛋白2、巢蛋白、胰-十二指肠同源盒1 基因、胰岛因子1 基因等，可以在大鼠体内起到很好的降糖作用。随着BM-MSCs 的研究越来越多，研究人员发现BM-MSCs 除了能增殖分化成多种细胞，还能分泌多种生长因子、细胞因子等，这些旁分泌因子可以调节和改善炎症反应，修复损伤组织，这为BM-MSCs 移植方式提供了新的思考。有鼠源实验证实，大鼠BM-MSCs 与胰岛细胞共培养可以减轻胰岛细胞在分离培养过程中的损伤，保护胰岛细胞功能，延长其寿命。实验结果表明，与单独培养的胰岛相比，与BM-MSCs共培养的胰岛平均存活率更高，且间接接触培养的胰岛活性更好，这进一步揭示了BM-MSCs 分泌作用的存在［10］，在BM-MSCs 与胰岛共移植中，分泌作用是BM-MSCs 发挥保护作用的主要机制［11］。另外有猪源实验证实，猪BM-MSCs 可通过上调微小RNA-299-5p 对SIAH1 蛋白表达产生抑制作用，进而抑制氨基末端激酶信号通路的激活，抑制脂多糖诱导的炎症反应和氧化损伤，改善猪胰岛细胞功能［12］。此外，BM-MSCs 具有易于获得、分选和体外培养的优点，也具有良好的组织植入能力，可以有效地延长共移植中胰岛细胞的寿命，是共移植治疗糖尿病中的主要干细胞［13-14］，而且基于大量研究的背景，BM-MSCs 已成为间充质干细胞共移植领域作为对比的金标准。随着研究进展，BM-MSCs 与胰岛共移植有望作为改善DM 患者β 细胞功能的常规方案。

2.2 脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）治疗：AD-MSCs 来源丰富，极易获取，是最常用于胰岛移植的间充质干细胞之一，其源自于胚胎发育时期的中胚层，是一类具有多分化潜能的成体干细胞，可以在特定的条件下诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、胰岛β 细胞和心肌细胞等多种细胞。本身免疫原性较低，其主要从脂肪中获取，取材方便，制备非常简便，经过简单机械剪切后，在胶原酶和DNA 酶的作用下，获得单细胞悬液，然后经过特定的培养基培养，即可获得，该细胞在体外增殖速度也非常快。因此，将AD-MSCs 应用于临床具有广阔的前景［15］。Bassi等［16］研究AD-MSCs 通过减弱 Th1 免疫应答，能有效阻断非肥胖（no obesity diabetes，NOD）糖尿病小鼠的自身免疫性糖尿病发病过程，且缓解了早发性自身免疫性糖尿病的高血糖症。Cao 等［17］的研究中发现，高脂饮食诱导的肥胖小鼠经静脉注射AD-MSCs 后，血糖在正常范围内波动，胰岛素抵抗症状明显缓解。谢敏等［18］利用尾静脉途径将AD-MSCs 输注到糖尿病大鼠体内。研究表明，ADMSCs 可以逆转2 型糖尿病大鼠的高血糖状态，在短时间内有效维持血糖正常水平，进一步研究观察到肝脏内糖酵解相关限速酶表达水平显著性上调，其机制可能是AD-MSCs 通过促进肝脏糖酵解进而调节血糖水平，逆转高血糖状态。张新静等［19］改进了AD-MSCs 的分离培养方法，采用新型胰岛β 细胞诱导试剂，不仅提高了其向IPCs 分化的诱导率，还提高了IPCs 的活性。也有研究表明［20］，“胰岛与AD-MSCs 共培养—置于共轴气流法海藻酸钠胶囊中—脉冲聚焦超声（pulsed focused ultrasound，pFUS）处理”三步法可以提高移植胰岛的功能。诸多研究成果为应用AD-MSCs 诱导生成IPCs 治疗糖尿病提供了理论和实验依据，也提供了AD-MSCs与胰岛共移植的可能性。

2.3 脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）治疗：为了扩展MSCs 种类，人们将目光转向了“围产期废物”，首先提取成功的便是UC-MSCs。UC-MSCs 由中胚层发育而来，可通过诱导分化为胰岛样细胞、上皮细胞、血管内皮细胞等，促进修复损伤的组织［21］；另一方面，获取细胞过程为无创操作，充分利用人体“废弃组织”，组织来源充分。因此，使其成为胰岛β 细胞替代疗法的重要新成员，已经成为当今生命科学的研究热点。科研证明，UC-MSCs 及其诱导后的胰岛样细胞具有更少的诱导排斥的表面分子，如CD80、CD86、CD40、CD40，证明了该细胞诱导前后均为低免疫原性，不易诱发免疫排斥反应［22］。且UCMSCs 定向诱导后治疗糖尿病效果明显，在体外向胰岛样细胞定向诱导28 d 后，经尾静脉移植到糖尿病大鼠体内，治疗效果显著［23］。研究表明，UC-MSCs也可以通过调节T 细胞亚群和Treg 细胞，保护胰岛功能并降低血糖。同时，三维培养的UC-MSCs治疗1 型糖尿病小鼠效果更佳，免疫调节功能更强［24］，其可能的机制为：① 在特定环境下分化为β 细胞，补充受损胰岛细胞的作用；② 释放抗炎和免疫调节因子并修复胰岛功能；③ 通过归巢并旁分泌多种细胞因子，改善胰岛细胞微环境［25］；④ UC-MSCs 的分泌功能在组织修复与免疫调节方面起着重要作用［26］，但其具体机制仍需进一步探讨［27］。邹俊彦等［28］发现UC-MSCs 输注可以增加2 型糖尿病小鼠肝脏自噬，其通过肝细胞磷酸酰肌醇激酶、磷酸蛋白激酶B 通路，促进自噬相关蛋白7 的表达，使包浆型自噬标志物向膜型自噬标志物转化，增加自噬溶酶体的形成，通过自噬作用清除病变细胞器，从而改善肝细胞代谢，缓解小鼠肝脏的胰岛素抵抗。同时，有研究发现胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体激动剂利拉鲁肽联合UC-MSCs 移植对T2DM 大鼠糖代谢及胰岛分泌功能的改善作用显著，其通过改善各种胃肠肽分泌，明显促进C肽（C-P）、GLP-1、胃泌素 （gastrin，GAS）和胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）分泌而抑制血糖升高［29］。UC-MSCs 还可以用于治疗糖尿病并发症，如UC-MSCs 能促进血管新生，并主要通过分泌生长因子发挥作用，如血管内皮生长因子（ⅦGF）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等因子，从而改善肢体缺血，促进创面愈合，改善糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）［30］。总之，UC-MSCs 功能多样，应用前景十分广阔，可以极好地应用于糖尿病及其并发症的治疗，有望成为与胰岛共移植的最佳伴侣之一。

2.4 人胎盘间充质干细胞（human placenta-derived mesenchymal stem cells，hP-MSCs）治疗：胎盘作为临床中最大的“废弃组织”，同样受到了科研人员的关注。hP-MSCs 是一组源于基质的异质细胞群，来源于发育早期中、外胚层，可以从胎盘组织获取。hP-MSCs 免疫表型和BM-SCs 一致，但增殖能力要比BM-SCs 强，而且由于其来源于胎盘，所以具有不易发生快速衰老、伦理争议小等优点［31］。经过多年的研究，hP-MSCs 在细胞治疗方面已显现出重要的作用。其发挥治疗作用的机制主要有以下几个方面：① 定向归巢作用；② 定向分化作用；③ 旁分泌作用；④ 低免疫原性作用［32］。而且hP-MSCs 在体外易于扩增，扩增倍数较BM-SCs 平均高出两三个数量级，且扩增后分化能力、增殖能力稳定，比成体干细胞具有更强的自我更新和多系分化能力，适合大规模制备［33-35］。研究发现，在体内和体外都可以将hPMSCs 诱导分化为胰岛样细胞，再通过尾静脉将其移植入妊娠期糖尿病大鼠体内，大鼠血糖均有所下降，胰岛素水平回升明显。这对于临床应用hPMSCs 治疗糖尿病有积极指导意义［36-37］。除此之外，hP-MSCs 也能迁移到缺血组织，释放抗炎因子进而减少炎性反应，同时促进血管生成，发挥修复功能，促进溃疡组织愈合，能诱导外周免疫耐受，修复受损细胞，延长其寿命。这些独特的特性使hP-MSCs 成为糖尿病周围血管病变（diabetic peripheral vascular disease，DPVD）细胞治疗的最佳候选者。但迄今为止，尚缺乏hP-MSCs 治疗糖尿病缺血性周围血管病变的相关临床研究报道［38］。主要是因为目前存在一些问题限制hP-MSCs 在临床上的应用，如其缺乏特异性的细胞表面标志分子；胎盘组织成分较为复杂；分离培养出不同部位来源的hP-MSCs 生物学特性研究不透彻等［39］，如人胎盘绒毛膜间充质干细胞（human chorionic villus-derived mesenchymal stem cells，hCV-MSCs）、人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）核型与胎儿相同，而人胎盘底蜕膜间充质干细胞（human decidua basalis mesenchymal stem cells，hDB-MSCs）核型与母体相同［40］，其分泌能力也不尽相同，如胎儿来源的间充质干细胞因其高表达人肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子，进而促进细胞增殖并抑制其调亡，加速创面的愈合，治疗慢性糖尿病溃疡疾病的效果更好［41］，而母体来源的间充质干细胞分泌血管内皮生长因子和血管生成素，进而增加血管通透性，促进内皮细胞的增殖和新生血管的生成，在治疗后肢缺血疾病方面更具有优势［42-43］。随着技术发展，MSCs 临床应用的增加，大量、安全的细胞培养体系的建立，hP-MSCs 很可能成为与胰岛共移植的干细胞中，造福更多的DM 患者。

2.5 神经脊干细胞（neural crest stem cells，NCSCs）治疗：Nagoshi 等［44］第1 次在啮齿动物的骨髓中发现NCSCs，同时表明了这种细胞也是MSCs。而且神经对胰岛β 细胞也有重要的调节作用，影响胰岛素的分泌，因此衍生出了NCSCs 作为胰岛共移植细胞的想法。已有实验表明NCSCs 能够改善移植的胰岛细胞的生存，并可以通过直接接触的方式刺激β 细胞的增殖，还观察到了其迁移的特性，并证明迁移在这个过程中是至关重要的［45］。NCSCs 接触胰岛细胞后，会促进细胞团球体形态的形成，甚至能够调节胰岛细胞团的大小，展现出天然的保护能力［46］。同时表达血管生成因子和神经生长因子，增加胰岛的血管的密度，改善神经的支配。Brboric 等［47］在研究NCSCs 对胰岛细胞影响的研究中发现，CD271+NCSCs 在培养1 周过后形态改变，类似于分化进程，而且大部分CD271+细胞都表达巢蛋白，分化后巢蛋白会被胶质纤维酸性蛋白、β-3 微管蛋白等所取代。但是，在同样培养条件下生长的CD271-细胞不具备以上特点。笔者由此推测并非所有NCSCs 都用于胰岛共移植。实验中还用到了来自多能干细胞诱导生成的β 细胞，证明了NCSCs 能够主动迁移向这些细胞，就像迁移至β 细胞，发挥保护功能，这可能对诱导的多能干细胞来源的β 细胞实现替代治疗有极大的帮助。NCSCs 的确在共移植体系中具有一定的价值。值得一提的是，这种细胞在我们人体内的含量极少，若想应用于临床，需要更高效的分离方法以及体外扩增培养的方案。在Liza 等［48］的实验中，证明胰岛中的神经不能仅仅简单归因于NCSCs 的直接分化，更有可能是NCSCs 分泌的相关神经营养因子的作用，因此得出结论NCSCs 不仅能够刺激β细胞的增殖，同时还能够改善移植细胞内部的血管生长和神经生长。通过神经的生长来改善移植胰岛的功能，这是其独有的优势，同时NCSCs 主动迁移、促进细胞团的形成，这是其他MSCs 中未观察到的，若是能自发形成并调控移植细胞团，这更有利于模仿胰岛细胞生理的空间状态，因此，其在胰岛细胞共移植领域有很大的前景，至少能给予我们启发。

3 其他类型干细胞

除了间充质干细胞外，也有许多其他来源的细胞在胰岛共移植领域有探索价值和应用价值。如骨髓来源的早期内皮祖细胞（bone marrow derived early endothelial progenitor cells，BM-EPCs）可以通过高表达VEGF 使血管密度明显增加，促进胰岛再血管化，在共移植中明显改善胰岛功能［49］。自体造血干细胞（autologous hematopoietic stem cell，aHSC） 可以促进β 细胞的再生，并根据血糖水平释放胰岛素以维持正常血糖［50］。人脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）可以诱导分化为胰岛β 细胞，逆转糖尿病鼠疾病症状，也能抑制炎症反应，并促进血管生成、加速伤口愈合［51］。人胆囊上皮干性细胞（human gallbladder epithelial stem cells，hGESCs）与人胆囊、胆管细胞（the gallbladder and cystic duct，GBC）可以作为胰岛细胞诱导分化的起始细胞，建立有效的胰岛细胞诱导分化体系，通过基因重组为β 样细胞发挥降糖作用［52］，也有相关的实验证实可以通过干细胞与胰岛共移植来改善胰岛β 细胞功能，期望通过进一步研究可以证明其临床应用价值，为临床治疗DM 提供稳定可靠的新方案。

4 总结与展望

DM 是一种多病因导致的慢性代谢性进展性疾病,中晚期进展为严重的不可逆性多系统并发症,且无法通过药物从根本上解决胰岛功能的损伤，因而临床上亟需一种药物以外的糖尿病根治方案使患者受益。因此，胰岛移植成为研究人员探索新方向，其可通过植入具有正常功能的胰岛细胞以替代患者体内功能受损的胰岛细胞，从而恢复患者血糖调节能力，稳定血糖调节系统，维持正常血糖水平，但这些植入的胰岛细胞在提取应用等过程中会失去固有的血管和细胞外基质营养支持作用，出现缺氧应激和坏死导致患者需要进行多次移植。然而供体资源相对短缺，并且患者在移植后需要长期服用免疫抑制剂等药物，这些困难成为胰岛移植应用于临床的不可突破的屏障。

随着近年来干细胞研究的深入，通过干细胞移植疗法改善胰岛功能给糖尿病的治疗提供很多全新的思路。首先，干细胞对胰岛β 细胞具有营养、支持、保护等作用；其次也可以发挥抗炎、免疫调节等作用，尤其是AD-MSCs，相对于UC-MSCs、BM-MSCs，其免疫调节能力更强，能够弥补单纯胰岛移植的不足；第三，其在体外可以自我复制增殖，并维持与亲代细胞相同的种群特征；第四，利用其定向诱导分化为具有产生胰岛素功能的IPCs 可减轻甚至帮助患者摆脱对胰岛素的长期依赖。这使得应用干细胞与胰岛共移植治疗糖尿病具有较为广阔的前景。除了干细胞与胰岛共移植外，干细胞体外辅助培养胰岛后进行单纯胰岛移植和干细胞外泌体机制研究也是热点的研究方向，都是具有潜力的干细胞改善胰岛移植预后的可能方式。但是根据动物实验及临床研究结果显示，胰岛与干细胞共移植仍然面临着很多问题。首先，干细胞的提取培养等技术尚未统一标准，临床使用的干细胞也需要符合药品生产质量管理规范的统一标准；其次，不同来源的干细胞各种能力存在差异，仍需探索出与胰岛共培养的最优来源干细胞；再次，与胰岛共培养的干细胞的剂量，输注方式、途径等都需要进一步的探索研究，进而确定出最优方案；从次，干细胞如何改善胰岛素抵抗、促进β 细胞再生、修复受损胰岛等具体作用机制还需要大量的临床试验研究［53］；最后，干细胞移植后不良反应、免疫抑制剂的应用标准以及是否有与胰岛共移植的可行性方案都需要进行大量的实验验证。随着科学研究的进展，相信胰岛与干细胞共移植定能为糖尿病患者带来新希望，成为治疗DM 的重要方案之一。