人乳头瘤病毒E6/E7mRNA 在宫颈病变中的研究进展△

见永康，吴泽俊，何娟，庄雅丽

安徽医科大学附属妇幼保健院妇产科，合肥 230000

宫颈癌是一种妇科常见的恶性肿瘤，近年来，宫颈癌在中国女性中发病率显著升高，引起了人们对宫颈癌早期筛查的重视。研究表明，高危型人乳头瘤病毒（high risk-human papilloma virus，HR-HPV）持续感染是导致宫颈癌的最主要因素[1]，在感染过程中，E6/E7 mRNA在宿主细胞中的表达发挥了重要作用。目前已发现的HPV有150多种，其中有40多种可导致宫颈病变。随着宫颈癌筛查技术的不断提高，大多数癌前病变能被及时发现并给予相应的治疗措施，在早期即可阻断其发生恶性进展的可能。因此，学习并继续推动宫颈癌筛查技术的发展有着重要意义。

1 宫颈癌主要早期筛查方法

宫颈癌病因明确，对已有性生活的女性来说，定期进行宫颈癌筛查具有较高的价值。

1.1 巴氏涂片法

巴氏涂片法最早应用于诊断宫颈癌前病变和宫颈癌，自问世以来，许多潜在病变得以被发现，极大地降低了宫颈癌的发病率和病死率[2]。然而，巴氏涂片法存在着较多缺陷，如刮板取材不全、涂片不均匀、细胞堆叠等因素使结果存在误差，最终导致其假阴性率高，存在着较高的漏诊率[3]。

1.2 薄层液基细胞学检查（thin-prep cytology test，TCT）

近年来，巴氏涂片法逐渐被TCT所取代。TCT使标本采集流程更完善，减少了干扰因素，诊断宫颈病变更加准确，其制片满意率和阳性检出率均明显优于巴氏涂片法[4]。但是，在宫颈病变早期，异常的宫颈鳞状上皮细胞尚未表现出明显的形态学变化，可能出现假阴性，这使此项技术存在着一定的误诊率或漏诊率。

1.3 HPV检测法

1.3.1 第二代杂交捕获法（hybrid captureⅡ，HC2）DNA 检测 HC2是现今应用最广泛的一种方法，它以核酸杂交技术为基础，与传统的HPV检查相比具有更高的敏感性。对高级别鳞状上皮内病 变（high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）的灵敏度（90%）与特异度（88%）均较高[5]。该方法可检测出13种HR-HPV，但不能区分具体的基因型，仅能对HPV的阳性和阴性进行判定，因此适用于大量人群的筛查[6]。

1.3.2 Cervista HPV检测 Cervista HPV检测分为Cervista HR-HPV检测和Cervista HPV 16/18型检测，Cervista HR-HPV检测可以检出14种HRHPV，对HSIL的灵敏度较高[7]。Cervista HPV 16/18型检测只能区分HPV 16/18亚型，在高危人群的筛查中有较高价值，可作为一种随访手段，在年龄大于30岁的女性患者中，对细胞学检查正常但HR-HPV检测结果为阳性的患者进行分流[8]。

1.3.3 Cobas4800系统法 该法以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术为基础，可检测出12种HR-HPV和HPV 16/18亚型，可进行具体分型，对于HSIL的特异度和灵敏度均很高[9]。

1.3.4 Aptima HPV检测法 Aptima HPV检测法是一种mRNA检测技术，能检测出14种不同的HR-HPV，但不能够具体分型。与HPV DNA检测技术相比，Aptima HPV检测法在保证灵敏度的基础上，具备更高的特异度[10-11]。与TCT相比，16/18/45分型检测对≥HSIL的风险预测能力更佳[12]。

目前，HR-HPV DNA+TCT在中国广泛应用于宫颈癌筛查，此项技术对宫颈早期病变的灵敏度较高，但特异度较低。

2 HPV 的生物学特性

HPV是一种由蛋白质外壳所包裹的双链环形DNA病毒。多数HPV感染机体后能被免疫系统清除，但也有少数HPV感染会转变为持续性。根据其对人体危害性分为高危型和低危型。其中，低危型HPV感染可无症状或引起寻常疣、尖锐湿疣等疾病，极少引起宫颈病变；而HR-HPV的持续感染则与宫颈鳞状上皮内病变的发生高度相关，若未及时发现病变并给予治疗措施，甚至有进展为宫颈癌的可能[13]。

HPV的致癌特性来源于致癌蛋白E6和E7。这两种病毒致癌蛋白的持续表达是宫颈上皮细胞表型转化的必要条件[14]，它们促进细胞分化并诱发肿瘤[15]。因此，要预测宫颈早期病变的后续进展或监测宫颈癌根治术后的复发，可监测宫颈脱落细胞中E6/E7蛋白的表达水平。

3 HPVE6/E7mRNA致病机制

几乎所有的宫颈癌或癌前病变患者都可检测出HPV感染。HPV E6/E7蛋白可影响正常细胞基因的表达。当E6/E7 mRNA所编码的蛋白质在细胞中持续存在时，可造成正常细胞的病理改变，引发不典型增生，导致不良预后。

E6蛋白是一种由160个氨基酸所组成的小分子蛋白质，主要通过泛素通路下调抑癌基因p53的表达。当机体存在持续性HR-HPV感染时，E6蛋白过表达，与细胞内的E6相关蛋白（E6-associated protein，E6AP）结合形成复合物，随之与p53基因结合并快速将其泛素化，使其过度降解。而p53基因在细胞凋亡与细胞老化的过程中发挥了重要作用，它的缺失使细胞在DNA受损后不能终止细胞周期，细胞基因组突变累积，最终导致恶性进展[16-18]。有学者发现，仅HR-HPV E6蛋白能够降解p53基因，低危型HPV E6蛋白对其亲和力较低[19]。

E7是一种酸性磷蛋白，能作用于细胞pRb蛋白而使细胞周期失控。转录因子E2F可调节细胞周期和DNA合成，在正常机体中，若DNA发生损伤，pRb基因即与E2F因子结合，使细胞周期停滞。当E7蛋白过表达时，可通过抑制pRb与E2F转录因子结合，降低pRb活性，使细胞不受控制地进入细胞周期，最终发生癌变[20]。

4 HPVE6/E7mRNA 在宫颈病变中的预测作用

HPV感染宫颈细胞后，会分化为游离型和整合型。一般来说，低危型HPV感染机体后，所导致的良性病变组织中以游离型HPV居多；而在HSIL患者的病变组织中则可见大量整合型HPV。在患者的HPV DNA检测阳性的情况下，若仅发现宫颈上皮细胞内存在游离型HPV并不能说明宫颈存在病变，但E6/E7 mRNA检测阳性表明HPV已将自身基因整合至宿主细胞中，开始了转录和翻译，是宫颈发生早期病变的特异性标志物[21-22]。

当宫颈组织细胞开始发生不典型增生时，通过筛查即可发现早期的病变。单独应用TCT检测宫颈病变的灵敏度较低[23]，而HPV-DNA检测的特异度较低，单独诊断的准确度都不高[24]。而编码HPV E6/E7蛋白的mRNA提供了病毒的遗传信息，其检测有助于评估宫颈早期病变的严重程度。近年来，宫颈癌筛查的重点已由确定是否存在HRHPV感染转变为确定宫颈上皮细胞是否存在HPV E6/E7 mRNA的转录或E6/E7蛋白的表达。有学者发现，在低级别鳞状上皮内病变（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）阶段即有 HPV E6/E7 mRNA表达，但其表达水平低于HSIL和宫颈癌[25]。

目前许多研究指出，HPV E6/E7 mRNA检测可以综合评估宫颈病变和浸润性宫颈癌发生进展的危险性，可以达到早期预防宫颈癌的目的。Coquillard等[26]研究发现，检测宫颈鳞状上皮细胞内是否存在HPV感染时，E6/E7 mRNA定量检测的灵敏度与HPV-DNA检测相近，但特异度更高。张莉[27]研究了148例疑似宫颈病变患者，发现HPV E6/E7 mRNA检测单独应用时的灵敏度（83.78%）、特异度（82.43%）、准确度（83.11%）、阳性预测值（82.67%）与阴性预测值（83.56%）均较高。刘佳佳等[28]研究了74例宫颈病变患者，发现HPV E6/E7 mRNA检测和HPV DNA检测对HSIL的灵敏度相当，但前者的特异度更高。此外，HPV E6/E7 mRNA检测对TCT结果为意义未明的不典型鳞状细胞（atypicai squamous cell of unknown significance，ASC-US）患者具有较高的特异度（91.7%），可作为ASC-US患者分流管理的有效措施。朱远航等[29]研究了112例ASC-US患者，同时行HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检测，发现HPV E6/E7 mRNA检测在受检患者中对发展为HSIL的灵敏度（94.44%）与HPV DNA检测相比无明显差异，而特异度（45.74%）明显高于HPV DNA检测（18.89%）。Johansson等[30]随访了211例年龄大于35岁的ASC-US患者，发现HPV E6/E7 mRNA检测结果为阳性的患者，未来4～5年内宫颈病变进展为HSIL的风险高于阴性患者。

HPV E6/E7 mRNA检测与其他方法联合应用时，可有效预测癌前病变的转归。杨艳[31]发现HPV E6/E7 mRNA检测结合TCT可以综合评估HSIL和浸润性宫颈癌发生进展的危险性。王俊飞等[32]研究了538例可疑宫颈病变的患者，同时行TCT和HPV E6/E7 mRNA检测，发现二者联合应用灵敏度和特异度分别为99.68%和39.29%，大幅度提高了灵敏度，有效降低了漏诊率。此外，HPV E6/E7 mRNA检测在与HC2-HPV DNA联合应用时，诊断宫颈病变的灵敏度为99.3%，特异度为56.7%，且对HSIL的诊断价值高于LSIL[33]。

5 HPVE6/E7mRNA在HSIL和宫颈癌患者术后随访中的应用

潜在的宫颈病变不断发展将大大提高宫颈癌的发病率。过去预防宫颈癌发生的有效方法是防止宫颈进一步病变，对于LSIL可采用药物保守治疗并定期随访；LSIL保守治疗无效、HSIL及宫颈癌患者以手术切除病变组织作为主要治疗手段。然而，手术后患者仍有病变组织残留或再次复发的可能，因此对术后患者进行随访非常重要。目前以TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA等为主要检测方法。HPV E6/E7 mRNA检测正越来越广泛地被应用于HSIL患者术后的随访。

桂定清等[34]发现在检测宫颈锥切患者残留病变或诊断其是否存在术后复发时，HPV E6/E7 mRNA检测与HPV DNA检测的灵敏度相当，但前者具有更高的特异度，可作为HSIL患者宫颈锥切术后评估其预后的有效方法。方恋等[35]研究了120例宫颈癌术后患者，发现在有病变组织残留或术后复发的21例患者中，20例患者的HPV E6/E7 mRNA为阳性，其灵敏度为95.23%，特异度、阳性预测值均为100%。Persson等[36]研究了133例宫颈癌根治术后患者得出结论，HPV E6/E7 mRNA检测对于预测宫颈癌根治术后残留病灶/复发的特异度高（93.4%）而灵敏度低（57.1%）。Zappacosta等[37]指出，在锥切术后患者的随访中，HPV E6/E7 mRNA定量检测较TCT与HPV DNA联合检查的特异度和阳性预测值高。

6 小结与展望

HPV E6/E7基因作为与宫颈癌相关的重要因素，已成为医务人员研究的热点方向。作为宫颈癌早期筛查的可靠手段，其诊断的准确度高，对于无HPV感染和宫颈病变的患者，避免了不必要的阴道镜检查，简化了诊疗流程，减轻了患者的负担，具有巨大的发展空间。尽管HPV E6/E7 mRNA检测技术相较于其他检测方法有着巨大的优势，但也不能否认其他检测方法在诊断宫颈癌早期病变与发展中发挥的作用。无论是哪一种检测方法，单独检测都无法达到最佳的筛查效果[38]。恰当选取多种方法联合应用，可提升其特异度与灵敏度，对宫颈癌的临床防治和降低宫颈癌病死率具有重要意义。