酶联免疫吸附法在饲料安全检测中的应用

古丽娜孜·海如拉 库来汗·巴依多拉

新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，乌鲁木齐830063

酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）自问世以来，以其高特异性、高灵敏度、操作简便等优势广泛应用于饲料、食品、生物和医药检测，且实验可重复，结果可定量定性判断，对检测人员技术要求较低，为国际认可且广泛应用的一类大批量样本检测技术。随着饲料安全问题关注度日益增高，ELISA 检测方法也逐渐应用到饲料及饲料添加剂的检测当中，为化学药物、有害毒素和微生物检测提供便利。

1 当前饲料安全中存在的问题

当前我国饲料安全中存在的问题主要包括6点：1）饲料中私自或使用性激素类（如甲基睾丸酮）、镇静类（如氯丙嗪）或皮质激素类（地塞米松）等违禁药物；2）不按照使用量或不按规定添加饲料添加剂；3）不按照药物休药期规定停药或不遵守药物间的配伍禁忌；4）饲料变质发霉或病原微生物超标；5）饲料及饲料添加剂标识不明确或标识不当等；6）销售变质或伪劣饲料及饲料添加剂产品。

2 ELISA 在饲料安全检测中的应用

饲料的安全检测往往需要在多种复杂基质的条件下对受检样品中含量非常低的有毒、有害或者违禁添加剂等进行定性或者定量的检测。我国是一个畜牧产业大国，对饲料的依赖性较强，因此饲料产品本身也具有流通快以及数量大等特点，在实际流通与应用中选择一种快捷、方便、灵敏度和准确度高，并且价格便宜的检测手段对饲料进行安全性检测非常重要。当前饲料安全检测中最常用的一套程序为：初筛（即取得该饲料样品是否存在某种有毒有害物质的初步信息）→检测（即对样本进行分离以及定量分析的过程）→确认分析（对是否存在的有毒有害物质进行确认，即定性分析）。ELISA 检测方法的灵敏度高，操作简便，对设备的要求较低，易于使用，并且检测速度快，可在短时间内得到检测的结果，适用于流通性强的饲料安全性检测，基于ELISA 检测法的众多优势，其已经被广泛地用于饲料安全检测中，对饲料中是否含有有毒、有害物质，违禁药品以及其他添加剂进行快速的筛检。

2.1 检测饲料中的盐酸克伦特罗

盐酸克伦特罗是一种可提高食用家畜瘦肉率的“瘦肉精”，我国于2000年明确提出在饲养过程中严禁饲喂盐酸克伦特罗，但仍有养殖户私自滥用，人类摄入过量后会损害体内脏器，并出现心慌、恶心、呕吐甚至中毒症状。

孙明君等[1]利用间接竞争ELISA 方法检测饲料中盐酸克伦特罗残留情况，发现该方法的最低检测限为0.05 ng/mL，与莱克多巴胺的交叉反应率为7.75%，证明ELISA 检测技术具有快速、简便优势，可广泛应用于进出口饲料这类大批量现场检测。贺健强等[2]利用ELISA 方法、液相色谱串联质谱法（LC-MSMS）对动物饲料中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺进行检测，发现ELISA 在初步快速筛查时具有一定优势，不仅能准确定性，还能提供定量参考，与LC-MSMS 检测方法相比，ELISA 是一种适合大量样本筛查饲料“瘦肉精”的检测方法。

2.2 检测饲料中的沙门氏菌

沙门氏菌是一类血清型和种类繁多的病原菌，传统检测方法为细菌培养和生化鉴定，但是该方法耗时长，且假阳性较多，而ELISA 检测方法是一类准确性较高的检测方法。斑点酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）在传统ELISA 检测试验基础上，将原有的聚苯乙烯微量反应板更换为纤维素膜，此种改进可以增强抗原或抗体对载体的粘附度，所需检材少，操作简便，结果可读性高，通过颜色斑点有无或色泽可判断定性和定量结果。

韩志辉等[3]利用Dot-ELISA 对饲料厂100 份成品饲料进行检测，结果发现饲料中沙门氏菌阳性检出率为38%，同时和常规的分离鉴定技术相比，发现Dot-ELISA 检测方法具有较高的符合率，数值可达82.23%，该结果表明ELISA 检测方法也具有较高的准确率和特异性，在多饲料样本沙门氏菌的检测中可广泛应用。雷风[4]利用Dot-ELISA 检测鱼粉中是否含有沙门氏菌，检测发现64 份鱼粉为沙门氏菌阳性样品（总样品数为85 份），其检出率为75.29%，而常规分离培养检出53 份沙门氏菌样品，Dot-ELISA 和常规分离培养符合率为78.13%，2 种不同检测方法不具有明显差异性，表明Dot-ELISA具有较高的准确性，检测结果可作为饲料病原微生物判断结果。

2.3 检测饲料中的黄曲霉毒素

黄曲霉毒素衍生物类型较多，其中黄曲霉毒素B1 的毒性和致癌性最为突出，动物和人类食用后会出现严重的中毒症状，并向癌症发展，因此对饲料中黄曲霉毒素的检测具有重要意义。

陈琛等[5]利用ELISA 和高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分别检测玉米饲料中的黄曲霉毒素B1 含量，结果发现用ELISA 检出样品为阳性，用HPLC-MS 检测也为阳性，比较2 个实验的用时、成本和准确度，得出ELISA 检测具有较高准确度，且操作简便，用时短，可适用于饲料中黄曲霉毒素B1含量的快速大量筛选，若要确证结果，可结合HPLC-MS 进行精准定量。马俊等[6]利用ELISA 和薄层色谱法（TLC）分别检测饲料中黄曲霉毒素B1 含量，ELISA 回收率为在94.0%～105.0%，而TLC 回收率为84.6%～90.08%，虽然TLC 检测方法的抗干扰能力强，但前期样本处理步骤繁琐，且获得的回收率和精密度不如ELISA，因此对于饲料中曲霉毒素B1 的检测，ELISA 方法更具有优势。

3 ELISA 检测的实验条件

ELISA 检测方法属于超微量级别的分析技术，其检测范围在ng 和pg 水平之间，因此在实验过程中对各种试剂、物料以及不同实验步骤的反应条件和实验者的操作等均有严格的要求。

3.1 对试剂及物料的条件要求

进行ELISA 检测实验使用的试剂可分为主体试剂和辅助性试剂两类。现在ELISA 检测实验中常使用的ELISA 商品试剂盒中包括了已经被包被的抗体微孔板、酶标记物的浓缩液、标准液以及酶基质、发色剂和停止液等足够进行96 个测量的主体试剂及使用的物料。实验者在使用ELISA 试剂盒进行检测时必须严格按照试剂盒所附说明书进行操作，并且在一次检验中必须使用同一批号的与试剂盒相对应的试剂，严禁使用过期的试剂或者物料。在一次实验中没有使用完的试剂以及微孔板应置于2～8 ℃的温度下进行密封保存，且不可重复使用微量孔。制备缓冲液、洗涤液以及样本稀释液等辅助性试剂时，应采取现用现配的原则。进行ELISA实验，对实验所用的蒸馏水的要求非常高，不合格的蒸馏水会导致实验失败的几率增加，使空白值升高，实验者应使用新鲜的双蒸馏水来进行实验试剂的制备。

3.2 对操作步骤的条件要求

在ELISA 实验正式开始前，实验人员应该提前将试剂盒与待检测的样品等置于20～25 ℃的环境中进行回温，在实验过程中，不同的样品以及不同的试剂均应该使用一次性的单独吸嘴，避免造成交叉污染，导致实验失败。在加样时则应注意操作的准确度，将样品加入至孔底，并且不能有气泡出现。在进行孵育培养时，由于ELISA 试验通常情况下都存在二次抗原抗体的反应，实验者应注意各ELISA 条板温度的迅速平衡性。当实验室温度超过20 ℃时，实验人员可将ELISA 板置于避光的试验台上，以方便随时观测。在进行ELISA 试验的洗涤步骤时应提高警惕，洗涤的程度决定着整个试验的成败，由于洗涤的目的是将反应液中未与固相的抗体或者抗原结合的其他物质，以及实验反应过程中的一些非特异性吸附在固相载体上的干扰性物质去除，如果反应板洗涤得不彻底，尤其是在最后一次中有酶结合物等非特异性的吸附物，则会导致空白值升高[1]。同时在洗板添加蒸馏水时应该将移液枪头的尖端置于微板孔的上方1 cm 左右的位置，将蒸馏水打出，切忌将板孔中的液体溅到或者接触到移液枪头上。

4 结 语

综上所述，ELISA 是一种超微量检测和分析方法，因此实验操作中要严格按照说明书步骤操作，每次试验必须应用同批次、有效期内的试剂，确保结果准确。蒸馏水在ELISA 检测中具有重要意义，若水质不符合要求，可能会出现假阳性或增高空白值，因此检测过程中要保证各个试剂符合实验要求，同时检测人员要配戴无菌手套，以免交叉污染。