去泛素化酶与妇科恶性肿瘤相关研究进展

孙格格，李新

(武汉大学人民医院妇产科，武汉 430060)

随着妇科相关筛查手段的普及和女性健康意识的提高，妇科恶性肿瘤的检出率逐年上升，且发病年龄趋于年轻化。据2020年世界卫生组织统计，全球妇科恶性肿瘤发病人数超过133.5万，病死率近60%[1]，严重危害女性身体健康。目前，妇科恶性肿瘤的主要临床治疗手段是根据患者情况选择个体化手术联合术后放化疗，但对于一些复发性和难治性肿瘤患者，治疗效果往往难以达到预期。因此，明确妇科恶性肿瘤发病机制及研发新型治疗药物逆转肿瘤耐药是亟待解决的难题之一。

泛素化和去泛素化是修饰细胞内蛋白质稳态的两种方式，具有可调控和互为逆向的特性，贯穿于细胞的整个系膜系统，相互协同动态调节多种细胞生命活动[2]。去泛素化酶(deubiquitinatase，DUB)催化去泛素化进程，使泛素分子与底物蛋白之间的连接断裂，起到校对蛋白降解程序，避免活性蛋白异常水解的作用，保证细胞周期、细胞增殖、凋亡及自噬相关信号通路等的正常进行。蛋白质合成和降解的失衡势必会改变机体新陈代谢及蛋白氧化还原稳态等，引发恶性肿瘤。因此，DUB的异常表达可能与肿瘤的发生密切相关[3]。近年来，关于DUB在妇科恶性肿瘤中的影响作用有一些新的进展[4-5]。现对DUB与妇科恶性肿瘤的相关研究进展予以综述，以期为寻找新的妇科恶性肿瘤治疗药物的靶点提供理论依据。

1 泛素-蛋白酶体途径概述

细胞内蛋白质的酶解方式分为两种：经溶酶体非选择性不耗能途径和经泛素-蛋白酶体高选择性耗能途径。前者通过溶酶体产生的组织蛋白酶降解外来蛋白、膜蛋白和长寿蛋白，约占20%；后者将泛素分子作为一种“标记”，特异性地标记异常蛋白和短寿蛋白，然后通过蛋白酶体降解这些“标记蛋白”，约占80%[6]。

泛素-蛋白酶体途径可以分为3个过程：泛素化、去泛素化和底物降解。泛素化是蛋白质被泛素共价修饰的过程，主要由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3协同调控[7]。消耗1分子ATP产生的能量使一个泛素分子与E1活性位点半胱氨酸结合，活化的泛素分子诱导E1构象改变，进而募集E2接收活化的泛素分子，E3促使泛素连接的E2和底物蛋白结合，泛素与底物之间形成异肽键，最后多泛素“标记”的底物在26S蛋白酶体中被降解为分子量小的肽段[8]。底物可与单个泛素或多泛素链结合。单泛素化参与调节DNA修复及S期染色质修饰，而只有发生多泛素化的底物才能被26S蛋白酶体识别进入降解过程[9]。

与磷酸化类似，泛素化修饰在DUB作用下的过程可逆。DUB能够通过以下方式发挥作用：①识别特定的泛素分子间的赖甘氨酸结合位点或泛素分子与底物间的异肽键，使蛋白质与泛素分子分开变为游离态，避免蛋白质的过度降解，维持体内蛋白质的平衡；②对泛素化修饰起校对作用，移除底物蛋白上的错误降解信号；③再循环游离的泛素分子；④恢复底物蛋白的活性[10]。DUB严格控制真核细胞内的蛋白质质量，维持细胞信号转导、DNA损伤反应、细胞周期、细胞生长与凋亡等生理活动的正常启动[11]。

2 DUB亚家族及其家族成员

目前已知人类基因组编码100余种DUB，根据其不同结构和作用位点，可初步分为7个亚家族，即泛素C端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs)、泛素特异性蛋白酶家族(ubiquitin-specific proteases，USPs)、卵巢肿瘤相关蛋白酶(ovary tumor-related proteases，OTUs)、JAMM/MPN结构域相关金属肽酶家族(JAB1/MPN domain-containing metallo-enzymes，JAMMs)、Machado-Josephin结构域蛋白酶家族(Machado-Josephin disease protein domain proteases，MJDs)、单核细胞趋化蛋白诱导蛋白家族(mococyte chemotactic protein induced proteins，MCPIPs)以及最新发现的锌指含泛素肽酶1(zinc finger containing ubiquitin peptidase 1，ZUFSP/ZUP1)[12-13]。

UCHs以包含一个起催化作用的UCH序列而得名，主要包括UCHL1、UCHL3、UCHL5和乳腺癌易感基因1相关蛋白1 4个家族成员，这些蛋白质的活动与癌症的发展有关[14-15]。Chen等[16]发现，乳腺癌组织UCH-L1高表达与乳腺癌患者化疗药物敏感性差相关，上调UCH-L1会破坏表皮生长因子受体的降解进程，进而抑制雌激素受体α转录，即UCH-L1的表达与雌激素受体α状态成反比。他莫昔芬和氟维司群作为雌激素受体拮抗剂，可用于治疗雌激素受体阳性转移性乳腺癌[1-2]。Chen等[16]研究发现，靶向UCH-L1可能通过促进EGFR的降解来增加和维持雌激素受体α的表达，使雌激素受体α(-)乳腺癌细胞对他莫昔芬和氟维司群敏感，表明UCH-L1可作为治疗雌激素受体α缺失或低表达的乳腺癌的新靶点。

USPs是目前发现种类最丰富的一类DUB，包括11个家族成员：USP1、USP10～16、USP17L2、USP18和USP19[17]。USPs的基因序列中存在两个短的高度保守序列(Cys结构域和His结构域)以及一组阻断泛素化进程的三联残基(半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺)[18]。在不同类型癌症中，USPs均上调，且其具有靶向小分子调节蛋白质降解的潜力，表明USPs是一个有临床价值的治疗靶点。Pozhidaeva和Bezsonova[19]发现，USP7过表达通过改变DNA损伤反应、凋亡和控制细胞周期促进肿瘤发展。Sun等[20]的体内外研究证实，USP11过表达可使结肠癌细胞增殖率增快、转移加速，而敲除USP11起抑制作用，故USP11在结肠癌发展中可能发挥癌基因的作用。Wu等[21]发现，USP20上调能够调节β联蛋白的去泛素化，诱导恶性肿瘤发生，而敲除USP20可增加β联蛋白的转化率，提高化疗敏感性。

OTUs包含18个半胱氨酸蛋白酶，其中大多数与肿瘤患者的预后有关。OTUs亚家族包括OTUB(OUT ubiquitin aldehyde binding protein)、OTUD(OTU deubiquitinase)、A20和OTULIN(OTU deubiquitinase with linear linkage specificity)4类[22]。已有研究表明，OTUB1和OTUB2可以调节DNA损伤反应，且在结肠癌中OTUB1水平升高[23-24]。Iglesias-Gato等[25]证实，OTUB1通过激活小鸟苷三磷酸酶RhoA促进前列腺癌细胞的生长和转移，靶向OTUB1催化活性相关药物可能被用于转移性前列腺癌的诊治。

MJDs是最小的DUB家族成员，由Ataxin-3、Ataxin-3L、JOSD(Josephin domain-containing protein)1和JOSD2组成。所有MJDs家族成员均含有发挥蛋白酶功能的Josephin结构域，其中Ataxin-3和Ataxin-3L由1个位于N端的单个Josephin蛋白序列和1个可折叠的C端序列组成；JOSD1和JOSD2仅包含单个Josephin蛋白结构域[12]。目前，人们对MJDs家族Ataxin-3蛋白的研究比较深入。已知人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因是最常见的抑癌基因之一，其表达受到抑制易导致正常组织发生恶变[26]。Sacco等[27]发现，Ataxin-3的高表达会引起人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因转录下调，进而促进磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号转导通路的过度激活，引发非小细胞肺癌。

JAMMs因其活性中心含有1个二价锌离子而成为DUB中唯一的金属蛋白酶。JAMMs包含12个家族成员，分别为COP9信号复合体5、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基14、含BRCA1/BRCA2的复合亚基3、含MPN结构域的蛋白质、类Myb，SWIRM和MPN结构域蛋白1、真核翻译起始因子3亚基H、COP9信号复合体6、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基7、真核翻译起始因子3亚基F、抗米勒管激素、抗米勒管激素样蛋白酶和前信使RNA加工剪接因子8[17]。重组抗米勒管激素已被证明能使与K63相连的K48多泛素链裂解成为泛素单体，从而抑制表皮生长因子受体泛素化[28]。含BRCA1/BRCA2的复合亚基3是一种新型致癌基因。Zhang和Zhou[29]发现，含BRCA1/BRCA2的复合亚基3在宫颈癌组织中表达上调且具有研究意义，其表达水平与临床分期和病理学分级呈正相关，敲低含BRCA1/BRCA2的复合亚基3能够下调基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达，抑制上皮-间充质转化，进而抑制宫颈癌的侵袭和转移。

MCPIPs包括MCPIP1、MCPIP2、MCPIP3、MCPIP4、MCPIP5、MCPIP6和MCPIP7[17]。MCPIP蛋白的共同特点是含有由3个半胱氨酸和1个组氨酸组成的锌指结构域和PilT蛋白N端结构域。其中，MCPIP1是目前研究较透彻的家族成员，它通过识别3′非翻译区中的特定茎-环结构参与转录物的降解。在肾透明细胞癌细胞系中，下调MCPIP1会促进上皮-间充质转化，从而促进肿瘤向邻近组织的侵袭和转移[30-31]。

ZUFSP/ZUP1是一类新发现的DUB，与其他已知DUB均无同源性。在ZUFSP中确定了两个泛素结合域，一个ZHA(ZUFSP螺旋臂)与远端泛素结合，另一个非典型UBZ域与聚泛素结合；两个结构域协同作用促使ZUFSP选择性切割K63连接的多聚泛素。ZUFSP可以定位于DNA链断裂部位，通过促进DNA损伤修复反应维持基因组的稳定性，还可以阻止细胞发生自发性DNA损伤，增强其低于外源性DNA损伤的能力，利于细胞的生存。人类癌细胞中ZUFSP的缺失既可导致内源性DNA复制应激，又可使细胞对外源性DNA损伤更加敏感[32]。

3 DUB与妇科恶性肿瘤

各类DUB家族成员在妇科相关恶性肿瘤的发生发展中起作用。由于作用靶蛋白各异，DUBs改变可能影响下游信号转导分子引起包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B[33]、核因子κB[34]、转化生长因子-β[35]等在内的信号通路持续激活或异常阻滞，影响恶性肿瘤的发生。此外，某些DUBs还能影响DNA损伤修复反应[5]，相应的抑制剂能够逆转肿瘤细胞对于化疗药物的耐受，增强药物效能。

3.1DUB与宫颈癌 宫颈癌是女性好发的第四大恶性肿瘤，据统计，2020年全球75岁以下宫颈癌患者约占女性人数的6.5%，中国和印度的患病人数占全球总宫颈癌患者的1/3以上[36]。多种DUB与宫颈癌的发生相关。Diao等[37]比较宫颈癌组织和癌旁组织发现，宫颈癌组织中USP18高表达，下调USP18能够抑制CasKi和SiHa细胞中蛋白激酶B的磷酸化。同时，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B抑制剂LY294002能够逆转高表达USP18对细胞增殖的促进作用，因此改变USP18的表达量能够影响磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路，进而影响宫颈癌细胞的增殖与侵袭能力。已知DNA损伤检查点蛋白的介质1的MRN复合物参与DNA双链断裂识别、信号转导和修复过程。Su等[38]发现，USP7在宫颈癌组织中表达上调，能够特异地去除DNA损伤检查点蛋白的介质1上的泛素链，阻断DNA损伤检查点蛋白的介质1的水解，维持DNA损伤修复反应，增强宫颈癌细胞抵御化疗药物引起的损伤，诱发耐药。Yin等[33]体内体外实验证实，OTUD5过表达组的C33A细胞中蛋白激酶B的磷酸化和泛素化水平低于OTUD5沉默组和野生型对照组，同时OTUD5过表达组的C33A细胞对放疗的敏感性高于OTUD5沉默组和野生型对照组，可见，可通过上调OTUD5抑制蛋白激酶B，进而提高宫颈癌的放疗效果。经体内体外实验证实，DUB表达的改变不仅影响宫颈癌细胞的增殖与侵袭，还能够逆转肿瘤化疗耐药，提高癌细胞对放疗的敏感性。

3.2DUB与卵巢癌 卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，由于其临床症状不典型且缺乏敏感的检测方法，大多数患者(60%)确诊时已为晚期[39]。目前紫杉醇与铂类化合物联合用药是卵巢癌化疗的常规治疗[40]，但长期化疗后，大多数患者可能复发，并产生化学耐药，故往往预后不佳，因此亟须探索逆转耐药的新机制和靶点。髓细胞性白血病1能够抑制细胞凋亡引发的耐药[41]。Wu等[42]发现，DUB3可使卵巢癌细胞中髓细胞性白血病1与泛素链分离，保护髓细胞性白血病1免受降解，O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶是DUB3转录的关键激活因子，其抑制剂PaTrin-2在体内外均可有效抑制卵巢癌细胞O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶的表达，同时他们还发现组蛋白脱乙酰基酶抑制剂可增加卵巢癌细胞对PaTrin-2的敏感性，表明组蛋白脱乙酰基酶抑制剂联合PaTrin-2可克服卵巢癌化疗耐药，提高疗效。Shen等[43]检测证明，USP14在耐顺铂的卵巢癌细胞中表达增加，并通过表达B细胞淋巴瘤家族基因 6抑制卵巢癌细胞的凋亡，从而增加卵巢癌顺铂耐药性。Wang等[44]研究发现，USP11高表达于卵巢癌细胞，其通过调控Snail蛋白促进上皮-间充质转化，诱发卵巢癌细胞的侵袭和转移。综上，DUB与卵巢癌的发生和进展相关，DUB抑制剂与常规化疗药物联合可能是逆转化疗药物耐药的新型手段。

3.3DUB与子宫内膜癌 围绝经期及绝经后是子宫内膜癌的多发危险期。目前，临床主要根据子宫内膜癌分期选择治疗方式，如手术切除术、淋巴结清扫术、术后辅助放化疗的单一或联合治疗，患者多预后良好[45]。但对于有生育要求的年轻患者以及预后不良的晚期患者，临床可选择的治疗方式存在局限，因此探索新的靶向药物具有重要意义。

机体内多种DUB的突变与子宫内膜癌的发生相关。FAT肿瘤抑制同源物4(FAT tumor suppressor homolog 4，FAT4)是一种与细胞黏附相关的蛋白分子。Che等[46]对子宫内膜癌中FAT4的作用机制进行研究发现，子宫内膜癌细胞中FAT4下调；且经细胞计数试剂盒-8和细胞迁移侵袭实验证明，沉默FAT4能够促进肿瘤细胞的增殖和迁移。Yes相关蛋白是Hippo信号通路的关键分子，参与调节细胞增殖、存活和分化，与肿瘤的发生发展相关[3]。Che等[46]通过实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法分析发现，FAT4的下调可使Yes相关蛋白表达增加，进而抑制Hippo信号通路的激活。Vogel等[47]的随访研究显示，子宫内膜腺癌复发患者USP14表达水平升高；Logistic回归分析显示，USP14与已知危险因素(临床分级与病理分期、淋巴血管间隙浸润和组织学)结合预测子宫内膜腺癌复发的效能优于单独危险因素；同时他们使用细胞计数试剂盒对31例子宫内膜腺癌患者肿瘤样本中USP14与Ki67的关系进行探讨发现，USP14与增殖标志物Ki67呈正相关，USP14表达上调可能是导致子宫内膜腺癌增殖和侵袭的必要条件，故推测USP14可能成为新的评估子宫内膜腺癌复发的临床检测指标。

4 小 结

DUBs是细胞内蛋白质处于动态平衡不可缺少的部分，其表达异常、突变均会改变正常的蛋白质调控机制，使癌基因、抑癌基因和DNA修复相关蛋白等的表达出现失衡、影响正常稳态调控机制，进而诱发恶变。目前，已知有多种DUB家族成员在妇科恶性肿瘤中表达异常，且影响临床化疗药物的敏感性，与妇科恶性肿瘤的发生发展密切相关。目前人们对DUB的了解仍十分有限，随着相关研究的进展，DUB调控妇科恶性肿瘤的靶标及其作用机制将逐渐清晰，特异性DUB抑制剂可能为化疗耐药提供新的解决方案，从而为妇科恶性肿瘤的治疗提供新思路。