肠紧密连接蛋白与肠道屏障功能

杨靖源，蒙俊，杨堃

(昆明医科大学第一附属医院a.麻醉科，b.心血管外科，昆明 650032)

肠道是吸收营养成分和水分的主要器官，同时它也构成了抵御外部环境有害物质和病原体的重要屏障。肠黏膜屏障包括机械屏障、生物屏障、免疫屏障、化学屏障，其中机械屏障是肠黏膜屏障的重要组成[1]。单层上皮细胞构成肠腔和黏膜组织之间的主要物理屏障，而细胞旁的空间由紧密连接封闭，紧密连接下面是黏附连接。紧密连接在细胞侧空间形成首要屏障，发挥重要调控作用，维持肠黏膜上皮屏障功能的完整性[2]。当肠道屏障功能受损时，肠道的通透性增高，肠内细菌及毒素可转移入血，从而导致肠源性的脓毒血症，脓毒血症继发的全身炎症反应进一步加重肠道屏障功能损伤，甚至引起脓毒性休克和多器官功能障碍综合征[3]。肠紧密连接蛋白结构是高度动态的，可使细胞不断适应其环境，肠紧密连接蛋白表达或功能的干扰以及(或)紧密连接蛋白完整性的破坏与多种肠道疾病及癌症相关[4]。现就肠紧密连接蛋白的结构和功能、肠紧密连接蛋白的破坏因素以及肠紧密连接蛋白的功能调节予以综述，以指导临床工作中的肠道屏障功能保护。

1 肠紧密连接蛋白的结构与功能

早在1963年，Farquhar和Palade[5]用电子显微镜发现了紧密连接，提出细胞间紧密连接是一种膜蛋白复合体，在上皮细胞及内皮细胞间的连接方面发挥作用。紧密连接由不同的咬合蛋白(Occludin)、闭合蛋白(Claudins)及闭合小环蛋白(zonula occludens，ZOs)组成，这三类蛋白与肌动蛋白细胞骨架将相邻细胞连接起来构成上皮屏障[6]。紧密连接蛋白通过赋予细胞间离子、小分子和溶质流动的选择性，在细胞旁的通透性中起至关重要的作用。此外，紧密连接蛋白还可以调节细胞极性，对细胞定向刺激的反应性、运输功能以及增殖起重要作用[7]。

1.1Occludin Occludin是第一个完整的形成紧密连接的跨膜蛋白[8]。其是一个分子量为65 000的蛋白，有4个跨膜结构域，转录后修饰成为几种剪接变体。Occludin含有一个小的胞内环和两个胞外环，其中胞外环1和胞外环2参与相邻细胞上表达的Occludin之间的亲和作用。Occludin末端为N端和C端，末端均位于细胞内，且C端部分较N端部分长，通过Occludin的翻译后修饰调控紧密连接的组装、结构和功能[9]。Occludin的C端结构域与各种紧密连接的细胞内蛋白相互作用，包括ZO-1、ZO-2和ZO-3，这种相互作用是将Occludin组装到紧密连接中所必需[10]。Occludin在维持紧密连接屏障中起关键作用，研究表明，在体内和体外肠上皮细胞中，Occludin的缺失将导致大分子的选择通透性增加[11]，造成肠道屏障功能损伤。

1.2Claudins Claudins于1998年首次被Furuse等[12]从鸡肝的一个纯化连接部分中分离出来。其是一个分子量为25 000～27 000的蛋白质家族，在哺乳动物中最多由27个成员组成，具有很高的序列同源性[13]。与Occludin一样，Claudins也可能受到翻译后和转录后调控，其结构与Occludin相似，仅C端较短。胞外环通过与Claudins或位于相邻细胞上的Claudins相互作用促进紧密连接的形成[14]。同时，Claudins可以形成不同特异性和通透性的细胞旁离子通道，它是调节紧密连接细胞旁通透性的主要决定因素[15]。此外，Claudins在肠道肿瘤患者中的表达是变化的，故被认为是癌症治疗的诊断标志物和靶点[16]。

1.3ZOs ZOs是连接细胞骨架和跨膜紧密连接蛋白的重要细胞内紧密连接蛋白，其中ZO-1、ZO-2和ZO-3均为多结构域蛋白，分别含有3个N端PDZ结构域、1个中心SH3(Src homology 3)结构域和1个与鸟苷酸激酶同源的区域，ZO-1可以与自身、ZO-2或ZO-3通过第二PDZ结构域的相互作用发生二聚反应；另外，ZO-1可部分通过其第二PDZ结构域与膜磷脂酰肌醇结合的能力而部分靶向或稳定在质膜上，但它们具有与跨膜Claudins和Occludin结合的良好特性[17]。ZO-1与其他紧密连接蛋白有密切联系，常被作为评价肠道屏障功能的指标。一项回顾性研究发现，细菌性脓毒症患者的血清ZO-1水平显著升高，而腹外感染源和腹内感染源患者的血清ZO-1水平比较差异无统计学意义，且可以与内毒素一样预测28 d死亡率[18]。

2 肠紧密连接蛋白的破坏因素

在肠道中，肠道微生物与宿主共同居住的不平衡可能威胁宿主健康，只有通过维持肠道屏障的完整性才能维持肠道微生物与宿主的平衡状态。通常任何感染或严重的额外肠外伤等均可能导致严重的创伤，从而引起肠道屏障稳态的显著改变，这将导致肠道紧密连接破坏，上皮细胞通透性增加以及随后的炎症信号造成的肠道细胞损伤[19]。

2.1肠道相关疾病 在肠道病毒感染和细菌感染中，紧密连接蛋白通常是细菌毒素或炎症因子的靶点，最终导致紧密连接蛋白结构的破坏，肠道通透性增加，从而进一步促进病原体移位至肠道外组织甚至血液循环[20]。致病性大肠埃希菌是腹泻的常见病原体，该细菌通过激活各种蛋白激酶(包括肌球蛋白轻链激酶等)引起一系列细胞反应，从而导致紧密连接结构破坏和细胞旁通透性增加[21]。另外，炎性肠病也会引起紧密连接蛋白的破坏。Tan等[22]研究发现，溃疡性结肠炎患者的Claudin-2表达上调，Occludin和ZO-1表达减少。炎症状态下紧密连接蛋白屏障功能受损，细胞旁通透性增加，最终触发细胞凋亡导致肠上皮损伤形成糜烂和溃疡，而免疫细胞通过破坏的紧密连接进入肠黏膜，通过刺激促炎细胞因子释放促进炎症级联反应，进一步破坏肠道屏障[23]。如果因肠道疾病感染引起了脓毒症，Claudin-2的表达水平会升高，而Claudin-5和Occludin的表达水平降低[24]。

2.2外科手术操作 围手术期应激和疼痛刺激可诱发细胞因子和急性期反应物释放，升高血儿茶酚胺水平，激活肾素-血管紧张素系统，然而交感神经系统活动增加和血液中儿茶酚胺水平升高会导致心动过速和内脏血管收缩。严重的血管收缩可能使血液重新分配到远离内脏的地方，进而降低小血管的通畅性，影响其灌流[25]。这种严重持续的内脏动脉收缩可能导致胃肠黏膜缺血，黏膜屏障破坏或应激性溃疡出血。如在腹腔镜或开腹结肠切除过程中，肠紧密连接破坏，肠道屏障功能受损，患者体内内毒素水平和肠道通透性均显著升高，并伴随细菌易位[26]。

2.3失血性休克 失血性休克是一种以组织灌注不足为特征的临床疾病。失血性休克通过破坏肠上皮完整性和增加通透性导致肠道屏障功能障碍。有研究表明，失血性休克可导致肌动蛋白解聚因子/粘连蛋白激活，选择性肠肌动蛋白细胞骨架破坏，并在休克早期发生紧密连接蛋白丢失[26]。这种肠道屏障的丧失会导致毒素和细菌的移位，从而加重炎症并导致感染。一项大鼠失血性休克的实验证实了上述观点，结果显示，休克大鼠回肠的肠黏膜绒毛出现严重水肿、增粗甚至坏死脱落，大量的细胞核发生固缩，上皮细胞紧密连接宽度增加；同时，休克大鼠回肠组织ZO-1、Occludin蛋白的染色变淡，分布出现不均匀，ZO-1、Occludin蛋白的表达水平明显降低[27]。

3 肠紧密连接蛋白的功能调节

肠紧密连接蛋白受到严格调节对于维持正常肠道屏障完整性至关重要。肠上皮细胞迅速增殖并快速更新，因此应严格控制紧密连接蛋白以避免对膜完整性的任何不利影响。紧密连接蛋白受多种物质的调节，这些调节均通过各种信号蛋白和信号分子来实现，但调节机制尚不明确[28]。

3.1细胞因子 细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。根据在炎症反应中的作用，其可分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子。在所有上皮细胞中，紧密连接的组装和拆卸是一个涉及内吞、迁移和再循环的动态过程，这个过程受到多种细胞因子的调节[29]。其中，促炎细胞因子主要包括白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21以及肿瘤坏死因子-α，它们会破坏肠紧密连接，改变肠道通透性，影响肠道屏障功能。然而，抗炎细胞因子(如IL-10、IL-11)则可以增加紧密连接蛋白的表达，维持肠道屏障的完整性。所以，通过抑制促炎细胞因子和增强抗炎细胞因子的作用来恢复免疫失调和调节肠道屏障功能，将为肠道疾病的治疗提供新思路。

3.2右美托咪定 右美托咪定是一种高效选择性的α2肾上腺素能受体激动剂，在临床常被用作麻醉、镇痛和镇静的辅助药物。近年来，研究已证实右美托咪定对多种器官具有保护作用，包括心脏、肺、肾脏、肝脏和小肠，可减轻炎症反应，激活抗凋亡信号通路，从而保护细胞免受损伤[30]。一项内毒素血症和脓毒症的动物实验表明，右美托咪定可减轻肠微循环功能障碍，减少肠黏膜细胞凋亡和紧密连接损伤，对内毒素血症大鼠肠上皮屏障有保护作用[31]。此外，在缺血再灌注动物实验中，右美托咪定预处理可显著减少缺血再灌注引起的肠组织损伤[32]。然而，当前的大多数右美托咪定研究均基于动物实验，且其机制尚未完全阐明，故还需要进行深入研究。

3.3表皮生长因子 表皮生长因子作为有丝分裂原，参与调节基础条件下的修复和生存以及各种损伤。有研究通过观察表皮生长因子对大鼠小肠缺血再灌注损伤后增殖和修复的影响发现，外源性表皮生长因子以类似于增殖和组织损伤的方式加速了缺血再灌注后ZO-1和Occludin蛋白的恢复，应用表皮生长因子后，绒毛上皮部分恢复，紧密连接蛋白表达有不同程度的恢复，共聚焦成像结果与蛋白质印迹法结果基本一致，共同证实了表皮生长因子对肠缺血再灌注损伤后紧密连接蛋白恢复的影响[33]。表皮生长因子对肠道损伤的生长修复提供了重要帮助，因此其在肠道相关疾病的治疗方面将有广阔的应用前景。

3.4维生素D 维生素D被认为与广泛的生物活性有关，其中包括维生素D在维持肠道内环境稳定方面的作用。如维生素D能稳定上皮间的连接，促进肠道微生物区系和肠道免疫之间的适当平衡[34]。在一项体外和体内胃蛋白酶-胰蛋白酶抗性的醇溶蛋白诱导的紧密连接损伤试验中[35]，维生素D能显著减轻紧密连接蛋白损伤引起的肠黏膜屏障通透性增加，同时通过维生素D上调紧密连接蛋白表达，显著减少髓系分化因子88的表达和Zonulin的释放，其机制可能与干扰髓系分化因子88依赖的Zonulin释放信号通路有关。另一项利用脂多糖诱导肠上皮细胞损伤的研究发现，脂多糖可使肠上皮细胞-18活力降低，而维生素D可抑制肠上皮细胞-18的炎症反应，恢复ZO-1和Claudin-2的紧密连接，减少损伤器官中肿瘤坏死因子-α的表达，阻止ZO-1的破坏[36]。这表明，维生素D的肠道保护作用，可能可作为一种肠道保护治疗策略。

3.5谷氨酰胺 在肠黏膜中，谷氨酰胺是一种独特的营养物质，可为新陈代谢、调节细胞增殖、修复和维持肠道屏障功能提供能量。研究发现，谷氨酰胺可以促进紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin的表达，其可能通过反式激活表皮生长因子受体、蛋白激酶C和促分裂原活化的蛋白激酶，诱导紧密连接蛋白的表达[37]。虽然谷氨酰胺是维持动物和人类肠道屏障功能的主要营养素，谷氨酰胺消耗会导致绒毛皱缩、紧密连接蛋白表达减少和肠通透性增加，通过补充谷氨酰胺可以在几种损伤实验条件下和某些临床情况下改善肠道屏障功能，但在临床实践中需进一步研究并评估谷氨酰胺，以减轻肠道不适并避免可能的高通透性并发症，如全身炎症反应综合征和败血症[38]。

3.6其他 除以上几种物质外，一氧化碳释放分子2、雌孕激素均对肠道紧密连接具有保护作用。一项实验发现，大鼠在盲肠结扎穿孔后，一氧化碳释放分子2可显著减少脓毒症引起的肠黏膜损伤紧密连接蛋白(包括ZO-1、Claudin-1和Occludin)减少、肌球蛋白轻链的磷酸化和促炎细胞因子的释放，总体揭示了一氧化碳释放分子2抑制了脓毒症诱导的肠上皮通透性改变，降低了脓毒症大鼠的死亡率[39]。近年研究显示，雌孕激素可减轻内质网应激，减少促炎细胞因子的产生，调节肠道上皮细胞，增强上皮细胞屏障功能，对疾病活跃度产生有益的影响[40]。

4 小 结

肠紧密连接蛋白对肠上皮屏障功能至关重要，不仅可以通过限制蛋白质在质膜内的运动以及调节细胞旁的溶质和水通量来维持细胞极性，同时还充当信号中枢。肠紧密连接蛋白表达、功能的紊乱和(或)肠紧密连接完整性的破坏与疾病发生发展相关。各种紧密连接蛋白的结构功能复杂，其与肠道疾病的发展转归存在复杂的关系。随着对肠紧密连接蛋白的不断研究，影响肠紧密连接蛋白信号通路方面的研究将不断深入，这也将为肠道屏障功能的保护提供更多重要的临床指导依据。