生物大分子相分离及其药物靶向技术研究进展

吴 晗，孙奋勇

(1.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科，上海 200127；2.同济大学附属第十人民医院检验科，上海 200072)

在真核细胞中，各种有膜细胞器通过磷脂双分子层将细胞分隔成具有不同结构和功能的区室，多种生化反应在区室内有序进行。此外，细胞内的生物大分子可通过发生相分离形成无膜细胞器，保证了区室内反应的高效性、独立性、精密性。目前已发现的无膜细胞器包括核仁、Cajal小体、P小体、应激颗粒[1]等，在真核生物细胞内的多种生命活动中均发挥着重要作用。相分离形成的生物分子凝聚物形同液滴，并具有液体样的性质。

蛋白质聚集是神经退行性疾病的主要标志，目前已在病理包涵体中发现了多种蛋白质，如TDP-43蛋白[2]、FUS蛋白[3]、α-突触核蛋白[4]和tau蛋白等[5]都会聚集并显示出相分离，其异常相分离行为可能是神经变性中蛋白质聚集的触发因素。

相分离和癌症进展之间也存在一定联系，多种凝聚物已被报道在癌症中发挥作用，如DNA修复灶、转录因子、RNA聚合酶Ⅱ、超级增强子等[6]。调节细胞中相分离动力学的治疗策略，可能是治疗具有异常生物分子凝聚物的神经退行性疾病和癌症的潜在手段。由于相分离是一个高度复杂的过程，许多类型的药剂，如小分子、抗体和人工合成肽，可以控制相分离过程并最终有效地治疗疾病。

1 相分离的概念、性质与研究历史

在工程学、物理学、化学领域，相分离是指当二元或多元系统稳定而均匀的单相状态被打破时，不同成分之间发生相互融合、相互阻隔，分离成具有不同结构和组成的几个相。在生物学中，相分离是溶液中互溶组分的可逆分离，产生两种不断相互交换的独立相：稀释相和包含其中的凝聚相[7-8]，如同油水相混，在静置状态下，最终分散在水面上的小油滴聚集在一起，形成大油滴浮在水面上，与水互不相溶。

相分离的凝聚物表现出类似液体的液滴行为，凝聚物可以相互融合，也可以发生裂变[9]。凝聚物具有选择性，一些大分子被并入凝聚物，另一些则无法进入凝聚物，被排除在凝聚物之外。且这一过程具有可逆性，凝聚物可能会溶解为游离的大分子[8-9]。相对于固体或类固体结构中的大分子，相分离凝聚物中的大分子通常具有更快的扩散和内部重排速度，这可以通过光漂白恢复试验证明[9]。相分离凝聚物中的大分子与游离溶液中的大分子具有更快的交换速率。相分离的凝聚物还会经历“老化”，老化的凝聚物可以由液体变为固体状或凝胶状[10-11]，且其内部重排动力学减慢，融合能力降低[3]，有时会形成网络和淀粉样聚集体[12]。

18世纪30年代，在神经元细胞核内观察到了第一个无膜区室，后来被称为核仁[13]。从那时起，在几乎所有真核细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上都发现了许多这样的隔室。它们可以相互融合，并且在光漂白恢复试验中可以与周围介质发生交换。2009年，Brangwynne等[14]在秀丽隐杆线虫中发现，P小体像熔岩灯里的液滴一样相互碰撞、聚集、融合，剧烈摇晃后会分散成很小的液滴，而后又很快地融合形成大液滴。这开创了相分离研究的先河，为无膜细胞器如何形成并在细胞内行使功能提供了新的思路。两年后，他们发现核仁也表现出类似液滴的行为[15]。2012年，研究在试管中发现RNA和蛋白质分子间也可以通过弱相互作用力发生液滴样融合，这证明了相分离可以在体外以生化反应的简单方式重现[16-17]。到2015年，相分离研究热潮兴起。Patel等[3]在肌萎缩性侧索硬化患者的神经细胞中发现，FUS蛋白发生异常相分离并形成蛋白质团块，这提供了凝聚物固相化的异常相分离可能导致疾病的首批具体证据。截至目前，已有多项研究证明相分离与众多生理过程及神经退行性疾病、肿瘤、病毒感染等的发生密切关系。

2 相分离的生理功能

相分离参与调节基因转录。研究提出转录共激活因子BRD4和MED1可以在超级增强子处发生相分离并形成液滴，将转录装置聚集在超级增强子附近，实现转录过程的区室化反应，可促进基因转录[18]。OCT4是胚胎干细胞特异性的转录因子，由转录激活结构域和DNA结合结构域构成。OCT4可以通过转录激活结构域与转录中介体复合物亚基MED1相互作用，在胚胎干细胞超级增强子处形成相分离凝聚物，从而激活基因表达[19]。

相分离参与调节信号转导。在肾足细胞的膜信号转导过程中，pNephrin-Nck-N-WASP通过多价相互作用发生相分离，而相分离的程度受分子间相对浓度调节。相分离通过增加N-WASP的膜上驻留时间，显著上调N-WASP的活性，增强其通过Arp2/3复合物促进肌动蛋白成丝的能力[20]。

相分离参与调节DNA损伤修复。53BP1蛋白是将DNA损伤信号转导至p53及其他肿瘤抑制蛋白途径中的一个重要传感器，在保持基因组稳定性和预防癌症的发生方面起重要作用。在有53BP1蛋白参与的DNA损伤修复过程中，53BP1蛋白存在液滴样的相分离现象[21]，这种相分离作用可能有助协调局部DNA损伤识别和全局基因激活。

相分离参与调节细胞稳态。蛋白酶体是一种主要的蛋白水解机器，通过选择性地降解泛素化蛋白来调节细胞中的蛋白稳态。RAD23B，作为蛋白酶体的底物穿梭因子，是诱导泛素化蛋白和蛋白酶体相分离的关键分子。RAD23B具有两个典型的泛素结合域(UBA)和一个蛋白酶体结合域(UBL)，通过UBA结构域收集细胞泛素化蛋白形成相分离液滴，然后通过UBL结构域招募蛋白酶体[22]。此外，由相分离驱动形成的无膜隔室对衰老相关疾病非常敏感，衰老及相关疾病的发生可能与细胞逐渐失去对细胞内稳态也即相分离的控制有关。

相分离参与调节X染色体失活。X染色体失活是调节失活X染色体基因沉默的重要生物学过程，而基因沉默又与癌症有着一定的联系。引发X染色体沉默的长链非编码RNA Xist是重要参与者之一，其通过多价E重复元件结合多种蛋白质，如PTBP1、MATR3、TDP-43和CELF1，然后通过自聚集和异型蛋白质-蛋白质相互作用在无活性X区室中形成相分离凝聚物[23]，其形成对强制执行X连锁基因沉默和锚定Xist至关重要。

3 相分离与疾病

异常相分离和凝聚物的形成与多种疾病的发生相关，如癌症与神经退行性疾病等。其致病原因大致分为3种[24]：凝聚物组装的异常、相分离调节剂的异常和细胞内物理化学条件的异常。

3.1 相分离与神经退行性疾病

神经退行性疾病的特点是认知或运动功能逐渐丧失，如在阿尔茨海默病和额颞叶痴呆中出现的认知缺陷及在肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病和帕金森病中出现的运动缺陷。

异常相分离形成的胞质或胞核病理性蛋白的区域聚集[25]已被证明与多种神经退行性疾病的发生相关。异常相分离可能会导致生物分子凝聚物丧失其动态特性，从可逆的动态相分离转变为不可逆状态[3,26-29]，称为“老化”，最终导致固态蛋白质聚集体的形成[30]。具有这种性质的相关蛋白包括TDP-43蛋白、FUS蛋白、α-突触核蛋白和tau蛋白等，它们所形成的异常凝聚物呈纤维样聚集在神经退行性疾病患者的受影响神经元中，导致神经元功能障碍并最终导致神经元细胞死亡。

在神经退行性疾病中，基因突变或重复扩增、异常翻译后修饰、亚细胞定位改变和蛋白质质量控制受损都可促进异位凝聚物的形成以及从类液体状态向固体状态的改变，导致病理性蛋白质聚集。以肌萎缩性侧索硬化和额颞叶痴呆为例，疾病相关的RNA结合蛋白(如FUS蛋白和TDP-43蛋白)突变促进其积聚在应激颗粒的相分离凝聚物中，加速凝聚物的“老化”，进而损害神经元核糖核蛋白颗粒的活性和功能。除了基因突变以外，异常的翻译后修饰也与疾病的发生相关，如FUS蛋白的精氨酸甲基化过程。在正常人脑中，FUS蛋白IDR区的精氨酸残基发生甲基化；在额颞叶痴呆的人脑中，FUS蛋白精氨酸甲基化的缺失促进了相分离的发生并降低了FUS蛋白凝聚物在细胞中的活力。此外，亚细胞定位的改变也可以通过影响相分离来导致疾病的发生。如FUS蛋白核定位信号的突变，降低了FUS蛋白与核输入受体转运蛋白的结合，导致核输入受阻，使得FUS蛋白聚积于细胞质中，促进了其相分离及“老化”[24]。

3.2 相分离与肿瘤

相分离提供了一个理解和解释突变如何导致肿瘤发生的新研究模型。在肿瘤细胞中，异常基因扩增、错义突变、染色体易位、定位改变和/或降解不当[31]，使得细胞环境和外部信号被错误调节，可能导致肿瘤中的相分离处于异常激活或抑制状态。肿瘤通常具有正常凝聚物破坏或异常凝聚物形成的特征。在某些肿瘤中，异常凝聚物与细胞转化(如癌基因的表达)有关；在另一些肿瘤中，异常凝聚物会促进癌症进展(如癌细胞的存活和转移)。其他与癌症相关的过程，如细胞代谢改变或上皮-间质转化，也受凝聚物功能障碍的介导。

致癌突变与特定的相分离缺陷有关。如肿瘤抑制因子SPOP，作为泛素连接酶的底物接头，可靶向各种原癌蛋白进行泛素化和蛋白酶体降解。由于SPOP的相分离需要其与底物结合，其致癌突变会破坏SPOP与底物的相互作用，从而破坏SPOP的相分离，也破坏了底物定位到相分离凝聚物中，导致细胞中SPOP底物原癌蛋白积累，促进细胞增殖[32]。转录失调同样与异常相分离相关。以转录共激活子TAZ为例，在肿瘤细胞中，Hippo信号的失活使得TAZ通过参与超级增强子与多个关键辅助因子形成相分离凝聚物来促进基因转录，促进肿瘤的发生。相反，Hippo信号的激活会诱导TAZ中卷曲螺旋结构域的磷酸化，抑制其发生相分离[33]。染色体易位也会破坏相分离，以早幼粒细胞白血病核小体(PML NBs)为例，其表现出相分离特性，具有调节衰老和维持端粒的功能。而PML和RAR之间的染色体易位会破坏PML NBs相分离凝聚物的形成，导致急性早幼粒细胞白血病的发生[33]。

越来越多的研究表明，肿瘤相关蛋白的相分离参与表观遗传、转录翻译调控、信号转导和蛋白质降解，在肿瘤发展中具有关键作用。以相分离调控信号转导为例，当免疫细胞中的T细胞受体(TCR)信号通路被激活时，下游效应蛋白自发地相分离形成动态的膜相关信号簇，使得ZAP70等激酶可以进入簇，而CD45等磷酸酶则不能。这种能力使信号簇能够放大输入的信号。致癌突变促进了异常TCR相关信号簇的形成，从而激活致癌下游信号[34]。

基于相分离在肿瘤病理生理过程中的作用，目前已有一些通过调控相分离而靶向治疗肿瘤的策略和方向，如调节相分离核心蛋白的浓度和翻译后修饰调控[35-36]；干扰相分离相关的结合分子，包括RNA和分子伴侣[19,37-38]；控制相分离的环境条件[39-41]；干扰相分离所需的外部介质，如膜表面等[42-43]。

4 相分离与药物研发

对于肿瘤的靶向治疗，传统的靶标大部分是具有明确活性位点的蛋白，并主要通过使用小分子占据驱动的药理学作用模式来控制蛋白功能。然而，有许多肿瘤的靶标，例如K-RAS、MYC和p53蛋白等，由于缺乏可被小分子靶向的蛋白质口袋，被认为是不可成药的[44]。鉴于已有研究发现一些不可成药的靶点受到相分离的调控，针对广阔的不可成药的相分离靶点设计药物，有望成为治疗相关疾病的新型策略。

由于相分离生物过程的高度复杂性，调节相分离过程进而治疗疾病的分子种类也很多样，包括小分子、抗体和人工合成肽等，可以通过靶向无序区、结构域或调节变构等途径来调节相分离。Girdhar等[45]发现，小分子吖啶衍生物AIM4具有很强的抗TDP-43聚集作用，并进一步证明AIM4与TDP-43无序区的残基结合以抑制其相分离。Zhu等[46]在SHP2突变体异常相分离现象中发现SHP2变构抑制剂ET070，可将SHP2突变体锁定在特定构象以抑制其相分离。Wang等[47]通过对SAS-CoV-2病毒核衣壳蛋白的二聚化结构域进行研究，设计出了一种特异靶向二聚化结构域的干扰肽以破坏其相分离，进而抑制病毒复制，恢复先天免疫。研究发现5种小分子化疗药物表现出选择性分配入凝聚物的性质，且可能可以用芳香环结构解释这种行为，这提供了相分离动力学角度的新治疗策略，为分子设计定制药物进入特定凝聚体提供了新的可能性[48]。

此外，新技术亦不断涌现。超分辨率显微镜(super-resolution microscopy,SRM)的出现为生物大分子凝聚物的表征提供了接近单分子的分辨率，并可用以直接定量成像。以BIN1为例，它是迟发性阿尔茨海默病的风险因素，De Rossi等[49]应用SRM发现了神经元中BIN1在突触前的位点和重要调节作用，及其缺失所导致的空间记忆巩固受损。有研究在体外建立了生物大分子的互作检测及高通量筛选互作调控物(phase-separated condensate-aided enrichment of biomolecular interactions in test tubes,CEBIT)的技术体系，其可用于观察化合物对蛋白质相互作用的影响[50]。

总的来说，相分离相关药物的设计和开发还处于起步阶段，而基于相分离蛋白结构的药物设计以及高通量筛选是相分离调节剂开发的可能途径。

5 总结与展望

相分离液滴具有随时间而发生“老化”的特点，并与疾病的发生相关。多价相互作用是决定相分离发生的必要条件，具有模块化结构域和/或内在无序区的蛋白质，可以通过多价相互作用的机制发生相分离。此外，凝聚物的形成与解离还受到环境因素的影响，如酸碱度、温度、ATP含量都可能影响相分离的发生。

异常相分离与疾病发生有着密切的联系。神经退行性疾病的特点是形成纤维状不溶性蛋白聚集体，其致病机制与治疗手段目前尚不明朗，相分离提供了阐释和治疗神经变性的新思路；肿瘤相关蛋白的相分离涉及表观遗传、转录翻译、信号转导和蛋白质定位与降解等多个生理过程的异常。可根据发生相分离的肿瘤相关蛋白致病机制进行药物研发。通过靶向无序区或结构域、调节变构等策略来设计抗体、小分子化合物及合成肽是药物研发的潜在策略。

随着相分离领域的萌生、发展和推进，越来越多的生物学功能和疾病发病机制都可以用相分离进行解释和阐明，为靶向治疗和药物研发提供了新的角度和无限的空间，而在相分离研究如火如荼的当下，也需要一些理性的思考。例如，相分离与生命过程的本质联系不明确，一些研究尚不能明确区分相分离与生命过程的因果关系，而只是简单证明其相关性；相分离的鉴定手段不完善，不能区分相分离和其他生命机制之间的区别，而只是现象性的描述；相分离的体外特性与细胞内性质的差别限制了研究成果的普适性等。相分离研究在生命过程、病理过程、药物研发领域仍有着很大的发展空间。