中性粒细胞外诱捕网在静脉血栓形成中的研究进展

奚 燕，朱 维，周 琳

(1.同济大学附属同济医院全科医学科,上海 200065；2.同济大学附属同济医院心血管内科，上海 200065)

静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)是指血液在静脉内不正常的凝固，使管腔部分或全部阻塞，包括DVT和肺动脉栓塞。VTE在临床中相对常见，且频繁复发，它是一种多因素疾病，涉及血栓形成和各种危险因素。在大多数国家，VTE已成为重大公共卫生问题[1-2]。众所周知，血管内皮损伤、血流速度缓慢和血液高凝状态是造成血栓形成的三大因素。尽管临床上已发现诱发VTE的多种危险因素，但血栓形成的机制仍未完全清楚。自2004年发现了中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap,NET)形成和释放以来[3]，新近的研究显示NET在VTE中也有着重要的作用。本文综述NET与VTE的关系，为未来通过抑制NET的形成、促进NET降解来预防或治疗VTE提供新的方向和临床思路。

1 NET的定义和组成成分

中性粒细胞是人体循环中最丰富的白细胞群体[4]。2004年，Brinkmann等[5]首次通过免疫荧光证实了NET的存在。在炎症刺激下，中性粒细胞释放一种网状结构，即NET。NET主要是DNA和组蛋白构成的网状结构[6]，此结构还装饰着大约20种不同的蛋白质，包括中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、髓过氧化物酶(MPO)、组织蛋白酶G、蛋白酶3、高迁移率族蛋白B1和抗菌肽LL-37等，在防御微生物中发挥重要作用[7]。

2 NET的形成过程

NET通过Nox(NADPH氧化酶)依赖途径或Nox非依赖途径形成，是一种区别于细胞凋亡和细胞坏死的新的细胞死亡程序[8]。中性粒细胞在激活后2～4 h死亡时会释放NET，这种形式的NET形成是由NOx依赖的多种促炎物质所诱导的，包括IL-8、肿瘤坏死因子以及一些药物例如佛波酯(PMA)等，其中诱导能力最强的就是PMA[8-9]。实验证实，PMA进入细胞后，导致了一种内质网钙源进入胞质，激活蛋白激酶C(PKC)，PKC通过激活NADPH氧化酶刺激活性氧(ROS)产生[9]，产生的ROS可以使中性粒细胞内的嗜天青颗粒释放NE和MPO；NE转移到细胞核后催化连接组蛋白的H1键断裂并修饰核心蛋白，介导组蛋白降解，帮助染色质解聚，解聚的染色质与降解的蛋白混合，形成NET[10-11]。2012年，Parker等[12]发现了不依赖NOx的NET形成机制，当人体受到某些细菌感染时这些细菌会释放一些物质，如离子霉素。离子霉素是一种Ca+载体，在NET的形成Nox非依赖途径中起关键作用。大量的离子霉素可以诱导细胞外的钙离子内流，内流的钙离子与胞质中肽基精氨酸脱氨酶4(PAD4)结合，导致组蛋白上带正电荷的精氨酸活化为不带电荷的瓜氨酸，不带电荷的瓜氨酸与DNA的静电结合力减弱，进而引起染色质的解聚[10，13]。染色质解聚后进入到细胞质中，并结合MPO、NE等颗粒酶及其他蛋白，最终释放至胞外，从而导致NET形成[8-14](图1)。但NET形成的详细过程还需进一步研究。

图1 NET的形成过程Fig.1 Formationprocess of NET

3 NET与静脉血栓形成的关系

3.1 NET激活凝血级联反应

NET的主要成分是DNA、组蛋白以及NE[15]。有研究表明NET可以不通过血小板，直接激活凝血酶原从而诱导凝血酶的生成[16]。Von Brühl等[17]发现，NET中的DNA可以直接激活凝血因子Ⅻ，从而激活内源性凝血途径，即通过DNA表面的负电荷与凝血因子Ⅻ表面的受体结合，诱导凝血因子Ⅻ的构象发生改变，导致少量活化凝血因子Ⅻ(FⅫa)的产生；产生的FⅫa可以导致血浆前激肽释放酶(PPK)裂解，产生有活性的血浆激肽释放酶(PK)，激活大量的FⅫ,从而启动了内源性凝血途径。为了进一步证明NET中的DNA可以促进血栓形成，研究发现在注射了FⅫ抑制剂(PCK)的健康小鼠中，血栓的重量显著减少，这种现象同样发生在缺乏FⅫ的小鼠中；相反，就FⅪ缺乏的小鼠而言，血栓的重量只是略微地减轻，这表明FⅫa促进血栓形成在很大程度上不依赖于FⅪ的激活，从侧面验证了DNA的作用[4，18]。总而言之，这些实验都表明NET中的DNA在凝血途径中发挥重要作用。研究还发现，NET中的DNA除了参与内源性凝血途径外，还能通过与纤溶酶和纤维蛋白形成复合物来抑制纤维蛋白降解，进而促进血栓的形成[19]。此外，还有实验证明，NET中的DNA还可以作为组织因子(tissue factor,TF)表达的支架，从而激活凝血级联反应[20]。

除了DNA，NET中的组蛋白在静脉血栓形成中也发挥着十分重要的作用。组蛋白可以通过血小板依赖性途径和非血小板依赖性途径分别促进血浆中凝血酶的生成[21]。在依赖血小板促进凝血酶生成的途径中，Semeraro等[22]用富含血小板血浆(PRP)探究了在依赖血小板途径中组蛋白是如何促凝的，此实验借助CA-T法测定了天然组蛋白混合物在人PRP中凝血酶生成的情况;将组蛋白(0～160 g/mL)与PRP孵育，在柠檬化的PRP中，组蛋白随着PRP含量提高不断激活凝血反应，从而使凝血酶的含量也不断地增加。在此实验条件下，为了避免自发激活的FⅫ通过内源性途径对凝血过程产生影响，且在不影响血小板在内源性途径发挥作用的前提下，实验又用柠檬酸盐和CTI(FⅫ的抑制剂)对PRP进行了处理，结果显示组蛋白仍能很明显地促进凝血酶的生成。在CTI抑制的PRP中，尽管接触系统的激活几乎被取消，组蛋白仍然能够诱导凝血酶的产生。由此可见，组蛋白促凝的作用不是通过内源性凝血途径发挥的。为了进一步验证此实验结果，在用CTI抑制的血浆中去除血小板，实验结果显示组蛋白不能诱导凝血酶生成，因此实验表明，组蛋白不能直接驱动凝血级联反应，而是通过激活血小板来诱导凝血酶生成的[19，23-24]。

此外，研究发现，非血小板依赖途径促进凝血酶的生成是组蛋白通过与TM蛋白(一种存在于单核细胞并且主要是内皮细胞上的跨膜蛋白)和蛋白C结合来减少蛋白C系统激活而实现的[22]。此外，组蛋白还可诱导血管内皮细胞、巨噬细胞和单核细胞表达TF，从而通过外源性途径激活凝血功能[25-27]。在体内，大多数磷脂存在于细胞膜中，组蛋白通过形成孔道、破坏细胞膜以及诱导的离子内流导致内皮细胞损伤，从而使抗凝屏障破坏。在组蛋白诱导内皮细胞损伤甚至死亡的过程中，可能会释放出过氧化氢(H2O2)，这也是NET形成的一个重要原因[6]。当使用重组组蛋白时，组蛋白的促凝作用似乎主要是由H3和H4介导的，其他类型的组蛋白没有或至多有轻微的促凝效果，这表明H3、H4在促凝作用中扮演关键角色[23]。

NET的其他组成成分也被证明通过调节或降解内源性抗凝剂来增加凝血酶的生成。Kambas等[25]通过免疫印迹法和激光评估NET中TF的表达情况以及对中性粒细胞来源的微颗粒表面TF进行检测，发现中性粒细胞来源的TF在NET诱导的血栓形成过程中发挥重要作用。除此之外，NET中的NE还能够裂解组织因子途径抑制剂和增强凝血因子Ⅹa活性[26]。众所周知，外源性凝血途径是从释放TF开始的，而NET中的NE可以使组织因子途径抑制剂水解而失活，从而促进外源性凝血过程。

3.2 NET作为血小板、红细胞黏附聚集的支架

NET促进血栓形成的主要方式之一就是为血小板、红细胞的黏附提供支架[4，27]。这种支架的形成不仅是血栓形成的结构基础，而且支架上的许多成分还可以积极地激活凝血过程。为了探究NET是否为血小板、红细胞等的聚集提供支架，Fuchs等[28]在体外采用PRP灌注NET，观察到血小板吸附在NET上；与此同时，借助全血灌注NET时，同样可以观察到类似的现象。为了进一步探究NET作为血栓形成的支架是否受其他因素的影响，有研究对NET和纤维蛋白分别进行溶栓，并将其敏感性进行对比。该研究首先降解NET，用t-PA(组织纤溶酶原激活物)去除纤维蛋白，并将用血小板激活因子预处理过的中性粒细胞释放到处理过的NET中，于复钙血液中孵育，结果显示，经组织纤溶酶原激活物处理过的NET仅可去除纤维蛋白，不能阻止与中性粒细胞相关血栓的形成，而采用组织纤溶酶原激活物和脱氧核糖核酸酶共同处理后的NET，虽然有活化的中性粒细胞存在但无血栓形成，由此可证实NET作为血栓形成的支架不依赖纤维蛋白[27]。

针对这一结果，Fuchs等[28]的研究更详细地解释了此过程，即用悬浮在血浆中的血小板灌注NET，观察到NET与血小板的强烈粘连，这直接证明了NET为血小板的聚集提供了支架。在灌注后的1 min内，NET上出现了小的血小板聚集物；接下来的9 min内，血小板的聚集物在NET上迅速增加；当用DNA酶处理NET后，血小板因NET的降解而不能发挥聚集作用，因此该实验进一步证明，血小板确实附着在NET上。除此之外，有研究通过把无细胞的NET(从被PMA刺激的中性粒细胞中收集)与人血小板孵育，发现NET单独存在(不加其他血小板激动剂)不仅可促进血小板聚集，分泌ATP和ADP，还能增加血小板表面CD62L和磷脂酰丝氨酸(PS)的表达[19，29]。

4 NET的临床应用

NET在深静脉血栓形成中发挥重要作用，寻找有特异性的抑制NET产生或破坏其结构的方法可能为VTE提供新的预防和治疗的途径。研究发现对于NET产生的Nox依赖途径，靶向性抑制NADPH或抑制ROS产生可以有效地减少NET生成。Parker等[12]发现利用NADPH抑制剂DPI可以减少PMA诱导的NET形成，DPI使PMA刺激所形成的NET降到最低水平，与此同时，DPI还阻止了铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌诱导的NET生成。ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸和ROS特定清除剂(Mito-TEMPO)可减少自发性NET的形成；MPO抑制剂如4-amino benzoicacidhydrazide[30-31]和PF1355可减少中性粒细胞聚集，从而减少NET的形成[32]。对NET的抑制，除了抑制其形成的通路，还可以靶向抑制其组成成分。NET主要由组蛋白和DNA组成，目前常用的NET抑制剂DNA酶，通过破坏NET结构发挥作用。DNase1被证明可以破坏DNA结构，但对组蛋白、弹性蛋白酶和其他NET的组成成分几乎没有影响。此外，对于肿瘤坏死因子和IL-17诱导产生的NET，利用相关抗体也能阻断NET的形成从而减缓疾病的进展[33-34]。目前关于NET抑制剂主要集中在动物实验层面，缺乏大规模的临床研究，主要是目前临床应用存在较大的局限性。首先，NET形成的确切机制尚未完全阐明；其次，NET相关的各种组成成分在血栓性疾病中发挥的作用仍需进一步探索。理解NET在VTE中的作用可以更好的理解血栓性疾病的发病机制，为VTE的预防和治疗开辟新的道路。

鉴于NET在众多疾病中都发挥着举足轻重的作用，寻找其诊断和治疗的方法就尤为迫切。高度特异性靶向药物的治疗效果明显优于非靶向药物的治疗。中性粒细胞释放的DNA和颗粒细胞质蛋白质，可以形成堆叠核小体(NS)[35]。单克隆抗体2C5对完整的NS具有很强的特异性，这表明2C5可能在NET中能够靶向抑制NS。有实验通过使用中性粒细胞和HL-60细胞在体外生成NET，采用ELISA评估2C5对NET的特异性，结果表明其与NET结合的特异性与纯化的核组蛋白底物相似[35-36]。此外，免疫荧光显示在静态和灌流微流控细胞培养中，2C5染色均呈网状，即使在网状压实后也是如此，用2C5修饰脂质体可显著增强脂质体与NET的结合。有研究表明，2C5可用于识别和可视化NET，并作为NET靶向诊断和治疗的配体,为其诊断和治疗开辟一条新的道路[36]。

5 NET与COVID-19

2020年初，SARS-CoV-2导致的COVID-19在全球各地开始暴发[37]。它常表现为流感样症状，并可发展为病毒性肺炎，导致多种并发症，其中最严重的是血栓导致的多器官衰竭[38]。经研究证实，新冠肺炎患者的凝血功能明显异常，发生病理性动脉和静脉血栓事件的风险明显增高。最新的研究表明，新冠肺炎患者的这些严重并发症可能与中性粒细胞产生的NET水平升高有关。早期的实验发现，中性粒细胞主要通过氧化和吞噬作用杀死病原体[39]。而现在大量实验证明NET的形成是中性粒细胞杀死病原体的另一种方法。虽然NET在宿主防御病原体方面的作用是有益的，但是持续的NET形成也会引起一连串的不良反应，包括破坏周围组织，促进微血栓形成，导致肺脏、心血管和肾脏等器官的永久性的损伤[40]。相关文献表明，严重的新冠肺炎及其并发症与细胞因子风暴有关，其特征就是血浆中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-17、IFN-γ等诱导单核细胞趋化因子1、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎性蛋白1α和肿瘤坏死因子α浓度升高。这些炎症介质调节中性粒细胞的活动，并诱导趋化因子(增加中性粒细胞向炎症部位运输的分子)的表达。特别值得注意的是，NET同时可以诱导巨噬细胞分泌IL-1β。如果重症新冠肺炎患者Net—IL-1β环被激活，NET和IL-1β的加速产生则可能会导致呼吸的失代偿、微血栓形成和异常免疫反应，从而导致重症患者的肺泡和肺内皮细胞过度损伤。内皮受损会导致血管性血友病因子(vWF)的释放，从而激活血小板和中性粒细胞。活化的血小板还能刺激中性粒细胞产生NET，与此同时，NET也为血小板、红细胞和纤维蛋白聚集提供了支架，从而有助于血栓的形成[41]。近期报道证明，新冠肺炎患者NET标志物(如循环游离DNA或DNA-NE复合体)水平的升高证实了NET的过度形成，与此同时患者血中NE活性也比正常人高30～60倍[42]。因此，针对重症新冠肺炎患者的相关并发症，NET可能提供了一条治疗新冠肺炎相关并发症的新出路。

6 展 望

自2004年发现NET后，大量的实验发现NET与众多疾病存在密不可分的关系，在血栓形成方面也发挥了重要作用。若能对NET的产生过程及作用机制有更深入的了解，明确其形成的分子机制及涉及的下游信号途径并能够对机体造成损伤的NET进行量化，则可开发出针对某种特殊成分或特殊环节的特异性的药物，从而进行靶向治疗。这不仅对静脉血栓性疾病的治疗具有里程碑式意义，与此同时，对NET的进一步了解也可为COVID-19相关并发症的治疗提供新的思路。