FMR1基因在脆性X综合征诊断及治疗中的应用进展

廖缘，曾晓玲，杨婧

(1.贵州医科大学，贵州 550004； 2.贵州省人民医院妇产科，贵州 550004)

脆性X综合征(fragile X syndrome，FXS)是智力障碍和自闭症谱系障碍的最常见疾病，男性发生率约为1/5 000，女性发生率为1/8 000～1/4 000，大多数FXS患者表现出注意力缺陷多动障碍、癫痫发作、焦虑和语言延迟等症状[1]。FXS的病因主要是脆性X智力障碍1(fragile X mental retardation 1，FMR1)基因启动子区域的CGG三核苷酸异常重复扩增，正常人中FMR1基因具有6～44个CGG重复，前突变患者有55～200个CGG重复，全突变患者有200个以上的CGG重复，相对于正常人，CGG重复增加会使DNA甲基化，导致组蛋白修饰、染色质重塑和转录基因沉默，脆性X智力低下蛋白 (fragile X mental retardation protein，FMRP)丢失，FMRP缺乏涉及大脑中信使RNA(message RNA，mRNA)代谢的多个方面，被认为是FXS表型的直接原因[2]。FXS可采用靶向治疗、病因治疗和对症治疗，靶向治疗会影响涉及FMRP的神经生物学通路，对症治疗主要通过抗精神病药物对FXS患者的症状进行治疗，病因治疗包括采用染色质修饰酶抑制剂、RNA或基因进行定向基因编辑以恢复FMR1基因表达[3]。目前针对FXS的有效靶向治疗进展缓慢，尚无药物被批准用于FXS的治疗，但在临床研究中有潜力的治疗策略正在研究中，现对这些治疗策略进行综述，以期为FXS的治疗提供参考。

1 FMR1基因

FMR1基因包含17个外显子，长度为38 kb，产生4.4 kb的mRNA，通过选择性剪接产生12种不同的FMRP，分子量为70 000～80 000[2]。FMR1基因包括甲基化区、启动子区、CGG段和编码序列，甲基化区域的边界位于CGG序列上游650～800个核苷酸处，在FXS中此边界不明显，主要因为启动子和CGG段被甲基化[3]。启动子包括约56个CpG位点(CpG 岛)以及位于CGG序列上游约130个核苷酸的3个启动子样序列。多态性CGG重复位于外显子1的5′非翻译区(untranslated region，UTR)，该序列超过200个可导致DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)识别CpG岛，DNMT向CGG序列中的胞嘧啶添加一个甲基，作为异染色质化和基因沉默的信号，甲基化的胞嘧啶被甲基化CpG结合蛋白2识别，CpG结合蛋白2激活组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)，进而去除甲基化的胞嘧啶附近的组蛋白H3和H4 N端区域的乙酰基，从而导致染色质凝聚[4]。

2 FXS的治疗策略

FMR1基因沉默涉及两种主要机制：CGG扩增超过200次重复和表观遗传修饰(主要是DNA甲基化)，以上机制会导致FMRP缺失，而FMRP缺失会导致FXS表型。理论上根据发生机制可以采用两种不同的方法治疗FXS：①针对由于FMR1缺乏导致的其他信号通路异常进行治疗；②恢复FMR1表达，作用于参与转录失活的表观遗传机制。目前有3个较为有潜力的针对病因的治疗方向。第一个治疗方向是FMR1基因的药理学再激活，这些药物可影响DNA甲基化和组蛋白修饰；第二个方向是用非编码RNA治疗FXS，尽管目前用非编码RNA治疗仍处于发展阶段，但已经显示出巨大的潜力；第三个方向是基因治疗，主要根据基因组的变化治疗FXS。研究表明，对CGG重复进行靶向基因组的编辑会导致FMR1启动子DNA完全去甲基化，并随后重新激活该基因[2]。

2.1基于FMR1基因的治疗策略

2.1.1地西他滨 地西他滨是一种去甲基化剂，已被包括美国食品药品管理局和欧盟委员会在内的多个监管机构批准用于血液系统恶性肿瘤的治疗[5]。地西他滨是激活FMR1基因表达的代表药物，可以抑制DNMT，目前已在人类中鉴定出3种活性DNMT，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，地西他滨可以插入到胞苷的位置，与DNMT1以共价键不可逆地结合，并在细胞分裂过程中导致DNA去甲基化[5]，但地西他滨对基因组DNA的去甲基化作用仅限于特定区域。经地西他滨治疗7 d后，重新激活FMR1转录的效果可持续1个月，且转录水平在使用地西他滨后10～15 d达到峰值[6]。高剂量的地西他滨会迅速引起DNA损伤和细胞毒性，患者可发生恶心、呕吐、腹泻以及中性粒细胞减少等不良反应[7]，这些不良反应极大地限制了地西他滨的使用剂量和治疗时间，故限制了地西他滨的应用。

2.1.2HDAC抑制剂 在FXS动物模型中，使用DNMT抑制剂进行全身治疗会导致组织中FMR1表达增强[8]。HDAC抑制剂具有独特的结构，针对全突变患者的淋巴母细胞使用3种可诱导组蛋白过度乙酰化的药物(4-苯基丁酸、丁酸钠和曲古抑菌素A)进行治疗时，FMR1基因被重新激活，与单独使用地西他滨相比，上述药物与地西他滨联用可使FMR1 mRNA水平提高2～5倍，组蛋白过度乙酰化与DNA去甲基化在FMR1基因重新激活过程中具有明显的协同作用[9]。经美国食品药品管理局批准的HDAC抑制剂，如罗米地辛、伏立诺他等，在FXS细胞中仅具有较弱的FMR1基因重新激活效果，且仅针对部分细胞，大部分HDAC抑制剂会诱导高水平的细胞毒性，因此HDAC抑制剂不具有作为治疗FXS药物开发的潜力[10]。

2.2针对非编码RNA的治疗策略 非编码RNA是一类非蛋白质编码RNA和功能性RNA分子，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、干扰小RNA等。非编码RNA参与人类多种疾病的发生发展。FXS的发病主要由RNA结合的FMRP丢失引起[11]。FMRP与神经细胞树突中的mRNA相互作用，从而调控突触的可塑性，并抑制突触蛋白质翻译。此外，FMRP还参与RNA干扰通路，并通过与不同miRNA相互作用调节重要神经生物学通路受体亚基的翻译[12]，如FMRP与miR-125b相互作用以调节N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基的表达，进而影响突触可塑性；FMRP与miR-125a的相互作用可逆地抑制突触后密度蛋白-95 mRNA的翻译，而突触后密度蛋白-95是谷氨酸受体定位的重要影响因素[13]。RNA干扰过程与组蛋白或DNA甲基化作用之间的关联涉及转录抑制，其中一些基因的转录抑制在FXS中较为常见[14]。研究发现，RNA干扰途径参与扩展CGG重复甲基化的过程，miRNA由包含CGG重复(rCGG)的切割的双链RNA产生，该结论基于rCGG可由RNase Ⅲ酶切割，且完全突变的CGG重复在早期胚胎发育过程中被转录[15]。此外，Suhl等[16]发现，1例非完全突变但3′UTR存在突变的患者神经细胞中FMRP表达水平降低，且miR-130b与突变基因中的3′UTR结合导致FMRP表达降低。在斑马鱼模型中发现，FMR1转录本与FMR1-miRNA水平呈负相关，在某些条件下，FMR1-miRNA表达的增加可诱导FMR1基因启动子区域的DNA高甲基化，导致FMR1基因转录失活和FMRP表达降低[17]。miR-219和miR-960在果蝇模型中发现，其中miR-219通过与3′UTR结合降低FMR1基因表达，表明该miRNA直接参与FXS的发病[18]。

非编码RNA(如lncRNA)通路可以影响染色质重塑和基因表达过程[19]。lncRNA与许多染色质修饰酶相关，这些酶可以调控组蛋白或DNA与染色质的相互作用，从而影响遗传信息的表达[19]。在FXS中观察到多种lncRNA，如FMR4、FMR5、FMR6、反义FMR1等，在这些lncRNA中，FMR6是一种与FMR1外显子15-17重叠的剪接反义定向lncRNA，可能参与调节FMR1基因转录，且FMR6可能与FMR1 3′UTR中miR-19a和miR-19b的结合位点重叠，通过miRNA途径介导FMRP的有效翻译[20]。

某些非编码RNA(如干扰小RNA和lncRNA)通过参与染色质重塑和DNA甲基化过程调节基因的表达和基因组稳定性，这些非编码RNA对研究FXS的治疗药物有指导意义。目前部分针对miRNA的药物正处于临床试验中，如miRNA模拟物、miRNA抑制剂等[21]。由于FMR1基因及其基因产物参与不同的非编码RNA通路，因此靶向非编码RNA通路可成为治疗FXS的靶标。虽然目前尚未开发出基于miRNA抑制剂的FXS治疗方法，且缺少关于FMR1基因敲除小鼠的实验数据，但由于CGG重复甲基化和异染色质化在FXS发病机制中的重要作用，因此可以基于非编码RNA的作用开发FXS的治疗方法。非编码RNA主要作为FMRP表达的负调控因子，通过降低CGG重复甲基化水平使基因表达正常化，且miRNA抑制剂可通过降低miRNA水平刺激FMRP表达增加[21]。

2.3病毒载体介导的FXS基因治疗策略 基因治疗是现代生物技术和医学中最有前途的研究领域之一，这种方法适用于治疗由基因组变化导致的无法治愈的疾病。基因治疗目前已被引入临床，诺华公司开发的Zolgensma于2019年5月获得美国食品药品管理局批准用于治疗脊髓性肌萎缩症[22]。

研究显示，在FMR1基因敲除小鼠中提高FMRP的表达可以挽救部分FXS表型缺陷，如大睾丸、焦虑和听觉反射性癫痫发作的易感性，将人类FMR1的互补DNA或包含整个FMR1基因的酵母人工染色体引入小鼠可诱导FMRP表达[23-25]。在一项关于使用含有FMR1编码序列的重组腺相关病毒(FMR1-AAV5)的研究中，将FMR1-AAV5载体注射到FMR1基因敲除小鼠的海马体可以改善小鼠的长期抑郁，而该病症与突触可塑性异常有关[26]。另一项研究将含有神经元特异性的突触蛋白1启动子的FMR1-AAV9载体注射到5日龄FMR1基因敲除小鼠的侧脑室发现，FMRP在多个前脑区域表达，但在注射部位的远侧和尾部区域未检测到FMRP的表达，且可逆转小鼠异常的重复行为，但运动过度、超声波发声和听觉反射性癫痫等症状并未消除[27]。后续研究发现，FMRP的表达水平在前脑结构中最高，在中枢神经系统和尾部等区域较低[28]。研究显示，FMR1-AAV9治疗逆转了小鼠的焦虑状态和听觉惊吓反应，并部分逆转了运动过度；在生化方面，突触后密度蛋白-95和转录调节剂甲基化CpG结合蛋白2的表达改善[27]。较高水平的FMRP可改善FMR1基因敲除小鼠的部分症状，表明当FMRP表达水平是野生型FMRP表达水平的35%～115%时可以治疗表型缺陷[28]。

2.4基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技术的基因疗法 CRISPR是一类重复的DNA序列，与CRISPR相关基因协同作用，使细菌获得抵抗噬菌体和质粒DNA的免疫力。在这种免疫反应过程中，入侵的DNA首先被切割并整合到CRISPR基因组中，然后该基因组被转录为单个非编码前体CRISPR RNA，并进一步加工成成熟的短片段，成熟的短片段最终与内切核酸酶Cas9形成核糖核蛋白复合物，后者识别并切割入侵的DNA。采用CRISPR技术进行基因编辑是基因治疗研究的最新方向，目前已有学者将CRISPR用于FXS的治疗。在体外实验中，CRISPR技术导致了具有FMR1基因的完全突变的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)中CGG重复序列的减少，这些细胞用编码Cas9的质粒进行电穿孔，并使用单导向RNA(single guide RNA，sgRNA)靶向CGG重复序列上游的序列末端，在2%～3%完全突变细胞中CGG重复序列被完全删除，且细胞基因启动子发生去甲基化，重新激活FMRP的表达[29]。使用两个sgRNA靶向三核苷酸重复上游和下游的序列可以导致约67%CRISPR编辑的杂交克隆系和20%的人类FXS iPSC克隆系基因的重新激活，重新激活的克隆系在启动子区域表现出低水平的DNA甲基化，而未激活的细胞表现出原本的甲基化水平，这可能是由细胞复制后不完全再甲基化所导致，因此分裂越活跃的细胞越有可能表现出有效的FMR1再激活[30]。

失活Cas9-DNA甲基化羟化酶(nuclease-dead mutants of Cas9-tet methylcytosine dioxygenase 1，dCas9-Tet1)是一种编辑工具，包含催化失活的Cas9(dCas9)和Tet1，Tet1是一种诱导胞嘧啶去甲基化的酶，通过慢病毒转导dCas9-Tet1/sgRNA逆转CGG重复序列的超甲基化，可在体外重新激活iPSC，进而重新激活FMR1的表达，并以最小的脱靶效应恢复iPSC中FMR1启动子的活性；修复了iPSC衍生神经元的异常电生理表型，移植到小鼠大脑后维持了编辑过的神经元中FMR1的表达，且有丝分裂后FXS神经元中CGG重复序列的去甲基化重新激活了FMR1(尽管效率低于FXS iPSC)，并逆转了小鼠的自发性过度活跃状态[29]。通过类似的方法，有学者将dCas9与转录激活因子VP192融合后在体外导入FXS人类胚胎干细胞和神经祖细胞，从而靶向重新激活FMR1基因，虽然这种方法在这些细胞中实现了较好的转录再激活效果，但并未观察到FMRP表达的显著增加，且与靶向启动子的sgRNA相比，靶向CGG的sgRNA能够诱导更高水平的转录活性[1]。在FXS小鼠模型中进行的首次体内基因编辑实验中，使用金纳米粒子将Cas9和Cpf1核酸酶递送到成年小鼠的大脑以靶向代谢性谷氨酸受体5基因编码代谢性谷氨酸受体5蛋白，在颅内注射编辑工具后，局部纹状体代谢型谷氨酸受体5水平降低，小鼠的过度重复行为得到改善[31]。

3 FMR1基因在FXS诊断中的应用

FXS的主要病因是位于X染色体(Xq27.3)上的FMR1发生突变，进而引起表观遗传上的修饰改变，导致相应的基因功能沉默，造成基因失活，从而引起一系列多系统的机体、行为和智力的改变[2]。FXS患者目前尚缺少针对性、有效的治疗方法，针对高危人群进行筛查及诊断是行之有效的方法。FXS症状不具有特异性，因此诊断难度较大。目前，男性FXS患者的平均诊断年龄为3岁，女性更晚[32]，早期诊断不仅可以实现早期干预和治疗，还可以减轻家庭压力。因此，对FXS进行准确、有效的早期诊断十分重要。

3.1FXS的诊断原理及方法

3.1.1基于FMR1基因突变的检测 美国医学遗传学和基因组学学院建议，对所有出现精神发育迟缓、智力障碍和(或)行为问题的个体进行FXS检测[33]。Southern印迹分析和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)通常用于估计FMR1基因CGG重复的大小和甲基化，两种方法联合检测是FXS分子诊断的“金标准”。多年来，基于PCR的分析方法得到改进，目前的方法可更精确地估计重复序列的大小、AGG的中断和甲基化状态，所需样本量更小，成本效益更高[33]。对于临床表型提示可能是FXS但CGG扩增呈阴性的个体，测序和多重连接依赖探针扩增等可用于识别拷贝数变异和单核苷酸差异[34]。在前突变和完全突变的女性携带者中，还需要确定影响临床表型的X-失活率(X染色体失活细胞的百分比)[35]。

3.1.2定量FMR1 mRNA和FMRP 根据CGG重复的大小，未甲基化的等位基因可能会产生部分FMRP，从而导致较轻的FXS表型，同时未甲基化的完全突变等位基因可产生FMR1 mRNA，其与FXS的毒性相关[36]。因此，测量FMR1的转录水平和FMRP水平对临床诊断有帮助，同时两者也可作为临床试验设计中患者分层的依据。逆转录PCR技术广泛用于测量FXS患者外周血和其他细胞类型中的FMR1 mRNA水平，而高通量测序是测量细胞裂解液和干血斑中FMRP的高灵敏度检测方法[36-37]。但这些检测方法是基于甲基化程度和嵌合现象的组织差异，无法确定外周样本(如血液和唾液)中测量水平是否能够准确反映大脑的水平。

3.2产前诊断 母系遗传是FXS常见的遗传模式，但男性携带者以及前突变者隐藏的风险仍不可忽视，产前筛查是防止FXS患儿出生的第一道防线。当孕妇已被证实为FXS携带者时，应当进行产前诊断。在我国，针对FXS的产前诊断远低于唐氏筛查，也只有极少数国家将FMR1基因筛查纳入孕妇的常规检查[38]。大多数国家建议针对CGG重复≥60的孕妇进行产前诊断，产前诊断可于妊娠10～12周进行绒毛活检或妊娠16～18周进行羊水穿刺，但由于妊娠前3个月FMR1基因甲基化不完全导致Southern印迹分析不易区分前突变和完全突变，因此还需要在孕中期进行羊水穿刺[39-40]。

4 小 结

药理学治疗方法是治疗疾病最常见和被普遍接受的方法，但基于分子生物学的治疗方法已经被开发并逐渐进入临床实践。FXS基因治疗是通过直接编辑CGG重复序列或传递诱导去甲基化的酶治疗疾病，基因治疗在FMR1基因重新激活方面具有较好的效果。目前，基因编辑在细胞系和动物模型中效果明显，部分药物已进入临床试验阶段。由于FXS对患者家庭及社会都会产生较大的压力和经济负担，因此要加强高危孕妇的产前诊断及咨询服务，推广普及FXS相关知识，有效降低FXS的发病率，改善患者的生活质量。