干预固有免疫反应治疗糖尿病心肌病的研究进展

周登双，刘嫚琪，吴子君，吴铿

(1.广东医科大学研究生院，广东 湛江 524000； 2.广东医科大学附属医院心血管内科，广东 湛江 524000)

糖尿病是一种以高血糖为主要特征同时伴有胰岛素缺乏和(或)胰岛素抵抗的慢性进行性代谢性疾病，其中2型糖尿病约占90%，预测2040年全球有6.42亿糖尿病患者，我国已确诊的糖尿病患者超过1.164亿，约占世界总患病人数的1/4[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DbCM)是基于糖尿病，除外高血压、冠心病等疾病引起的心肌病，表现为左心室肥厚和舒张功能减退，伴或不伴有收缩功能障碍。DbCM早期阶段已经出现心肌细胞底物代谢变化，线粒体功能异常，诱发微血管内皮和心肌细胞过度免疫炎症反应，进而导致微血管功能障碍，心肌细胞异常凋亡和间质纤维化，引起心功能不全。心肌免疫炎症反应包括固有免疫和适应性免疫两大类，而DbCM的免疫反应被认为倾向于前者。固有免疫又称先天免疫，即单核巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等固有免疫细胞通过模式识别受体识别病原体相关分子模式的结构或危险模式信号分子，募集活化后产生的免疫效应。干预这些免疫反应将一定程度上减轻微血管炎症，可能有效地改善糖尿病患者受损的心功能。目前已报道部分黏附分子、趋化因子及其受体、模式识别受体在DbCM中表达升高，在动物模型体内靶向这些分子已经显示出对心脏的保护作用，但具体作用于血管内皮细胞或心肌细胞尚不明确。现将近年来干预固有免疫改善DbCM的研究进行归纳整理，为减轻微血管病变以治疗DbCM提供更多的依据。

1 DbCM的病理生理机制

DbCM的关键病理生理机制主要分为两个方面，即局部微血管功能障碍和心肌细胞自身功能结构的异常。首先，糖尿病患者的心脏葡萄糖利用障碍，其更依赖于长链脂肪酸作为能量来源，但脂肪酸氧化因氧耗逐渐增加和微血管供氧障碍而导致效率低下，脂肪酸代谢中间产物累积产生毒性，钙离子失衡，心肌细胞收缩及舒张功能障碍且异常凋亡。其次，微循环障碍是糖尿病的特异并发症，其典型改变是微血管基底膜增厚和功能异常。良好的冠状动脉微循环在调节冠状动脉血流以及响应心脏氧需求方面起着基础性作用。当糖尿病患者心脏微血管内皮细胞遭受晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)和脂质氧化产物攻击，可出现微血管慢性炎症，血小板活化聚集[2]，成纤维细胞增殖和细胞外基质增加，血管周围纤维化，最终引起冠状动脉微循环血流受阻[3]。因此微血管病变可能是糖尿病心肌出现广泛性坏死的关键病理因素。Rajagopalan等[4]利用单光子发射计算机断层成像心肌灌注成像对无冠心病相关症状的糖尿病患者进行筛查，发现无症状糖尿病患者中存在心肌血流灌注缺损的占18%。这提示在糖尿病早期已经出现微血管病变，且影响了心肌血流的灌注。也有研究证明，糖尿病患者冠状动脉血管储备以及微血管阻力储备下降[5]。经皮冠状动脉介入手术可以改善糖尿病患者冠状动脉主要分支血流灌注，但难以有效改善其微血管病变。因此，在DbCM早期微血管病变已经影响了心肌血流灌注。

2 固有免疫在DbCM中的作用

固有免疫是机体抵御病原体入侵的首要防线。心脏固有免疫反应存在于其丰富的血管和致密的肌肉组织中，其重要组成因素包括危险信号、黏附分子、趋化分子、免疫细胞、细胞因子和模式识别受体等。糖尿病患者长期的糖脂代谢异常造成持续的微血管慢性炎症。AGEs、饱和脂肪酸、游离亚细胞碎片均可形成危险模式信号，从而启动糖尿病状态下心脏组织的免疫反应。饱和脂肪酸或AGEs均可与髓样分化因子2结合并激活Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)4引起心肌组织的炎症反应[6]。各种因素导致心肌细胞应激或损伤后，心脏组织或外周血中炎症细胞通过必要的免疫反应对凋亡细胞或失效的亚细胞器进行吞噬并清除，这种适当的免疫应答对机体有利。Nicolás-ávila等[7]研究表明，心室肌巨噬细胞通过受体型酪氨酸激酶信号摄取心肌细胞废旧线粒体碎片及亚细胞器的囊泡，减少炎症小体激活而维持心脏稳态，而分离这些巨噬细胞或敲除受体型酪氨酸激酶将导致心脏收缩及舒张功能减退。若刺激持续存在或刺激强度增大，募集大量外周血来源的免疫细胞浸润，甚至正常心肌区域也出现明显炎症细胞浸润，则引起炎症过度激活，细胞外基质胶原沉积和间质纤维化。研究表明，前壁心外膜植入组织工程的平滑肌细胞和内皮祖细胞双层细胞片可以减轻1型糖尿病大鼠的微血管功能障碍和心肌间质纤维化，血小板分化群CD31阳性密度降低，血管内皮生长因子、转化生长因子-β表达水平降低[8]，表明改善微血管炎症是治疗DbCM的有效措施。由此可见，过度的固有免疫可能伴随糖脂代谢紊乱，且贯穿于DbCM发生发展过程中。心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因,寻求DbCM的有效治疗策略十分重要，而改善微血管病变始终是极其重要的治疗策略。

3 干预固有免疫反应防治DbCM

固有免疫防御体系一般由组织屏障、固有免疫细胞和固有免疫分子组成。心脏富含微血管，微血管与心肌细胞之间上皮或黏膜形成的组织屏障能在感知危险相关分子模式后较快地启动免疫细胞与内皮细胞之间的黏附并且到达靶点。而持续高糖与饱和非酯化脂肪酸的长期刺激造成微血管固有免疫细胞募集和固有免疫分子表达，如糖尿病足和糖尿病肾病的组织微血管功能破坏，进而导致局部功能逐渐衰退。干预微血管的固有免疫反应可有效减轻微血管病变而治疗DbCM。

3.1干预黏附分子治疗DbCM 细胞黏附分子是介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互结合和作用的分子，参与细胞的附着和移动，细胞的发育和分化，细胞的识别活化和信号转导，是免疫应答和炎症发生的重要分子基础。黏附分子在微血管固有免疫反应中起到桥接内皮细胞和固有免疫细胞的作用。糖尿病患者体内血糖升高，当蛋白质接触醛糖后发生糖基化和氧化并生成糖化血红蛋白，经过分子重排形成AGEs,AGEs可与内皮细胞AGEs受体结合，从而激活核因子κB，诱导多种基因的转录，如内皮素1、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，以招募单核巨噬细胞等触发炎症反应[9]。高糖处理的人脐静脉内皮细胞ICAM-1和VCAM-1表达增加[10]；另外，糖尿病患者外周血中VCAM-1和中性粒细胞水平高于健康人[11]，且有并发症的糖尿病患者血清中可溶性VCAM-1水平明显高于无并发症患者[12]。注射ICAM-1抗体可减轻血管紧张素Ⅱ介导的心室重构[13]，但在糖尿病模型体内尚未验证。穿心莲内酯和木犀草素均可降低糖尿病小鼠心肌ICAM-1和VCAM-1表达水平，同时增加左心室射血分数[14-15]。另外，葛根素、白藜芦醇查尔酮分别降低糖尿病大鼠心肌ICAM-1和VCAM-1密度，并改善心功能[16-17]。但上述4种中草单体是否可通过调节内皮细胞分泌的ICAM-1或VCAM-1改善DbCM动物模型的心功能有待进一步探讨。

3.2干预趋化因子和趋化因子受体治疗DbCM 趋化因子是一类由细胞分泌的具有诱导附近反应细胞定向趋化能力的细胞因子或信号蛋白。例如单核细胞在单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1等作用下由微血管内皮迁移至全身组织器官，根据局部微环境不同分化发育为经典活化的M1型巨噬细胞和旁路活化的M2型巨噬细胞。人内皮细胞经高糖处理24 h后导致MCP-1增加[10]，并促进单核细胞与ECV304细胞(一种人血管内皮细胞)间的黏附[18]。对糖尿病患者分离的内皮细胞进行高糖处理后，MCP-1表达增加40%～70%[19]。MCP-1介导单核巨噬细胞的募集和激活，导致纤维化因子(如转化生长因子-β和骨桥蛋白)的增加[20]，对心肌重构发挥强大的纤维化作用[21]。这些证据表明高糖诱导血管内皮细胞的MCP-1基因表达增加，而有趣的是高水平的血浆MCP-1与晚期心力衰竭患者的不良结局独立相关[22]。研究发现，MCP-1竞争抑制剂可减少炎症性单核细胞募集，限制血管新生内膜增生[23]。可见，血管内皮细胞表达的MCP-1参与了糖尿病心肌炎症反应。有研究报道，姜黄素衍生物、丁香树脂醇、熊果酸等单体或衍生物可减少糖尿病小鼠心肌炎症细胞浸润并降低MCP-1表达水平，减轻心脏炎症反应[24-26]。而靶向MCP-1能否通过改善微血管内皮功能障碍延缓糖尿病心功能恶化有待进一步研究。与趋化因子结合的CC趋化因子受体2[chemokine (C-C motif) receptor 2,CCR2]和CXC趋化因子受体4[chemokine (C-X-C motif) receptor 4,CXCR4]均属于趋化因子受体家族成员，为7次跨膜结构的G蛋白偶联受体，与相应的趋化因子等配体结合后，启动胞内下游信号通路发挥效应。糖尿病小鼠心肌组织CCR2信使RNA和蛋白水平均明显升高，敲除CCR2基因可改善心肌纤维化和心功能[27]。CXCR4拮抗剂减少糖尿病小鼠心肌α-平滑肌肌动蛋白标记的细胞数量，显著减轻心肌纤维化[28]，且甘草素可降低糖尿病大鼠心肌组织CXCR4蛋白水平，进而改善心功能[29]。但CCR2和CXCR4等趋化因子受体与趋化因子的相互结合是否在冠状动脉内皮细胞上发挥调节DbCM的免疫作用仍有待证实。

3.3干预模式识别受体治疗DbCM 模式识别受体广泛存在于固有免疫细胞表面、胞内器室膜上，分布于组织、血液和胞质中，它们能够直接识别外来病原体及其产物，或发生畸变、衰老和凋亡细胞的某些共有特定模式分子结构。固有免疫细胞可通过模式识别受体结合病原体及其产物或体内靶细胞表面相关配体，介导产生非特异性抗感染、抗肿瘤和免疫调节功能，还参与适应性免疫应答的启动和效应全过程。几种胞质模式识别受体能够感知病原体相关分子模式和损伤相关分子模式，导致胱天蛋白酶1的募集和激活，并诱导白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18分泌。清道夫受体CD36、TLR和核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)等模式识别受体与DbCM密切相关。

3.3.1干预清道夫受体治疗DbCM 清道夫受体是一种跨膜糖蛋白，主要表达于巨噬细胞表面，通过受体介导的内吞作用将病原菌或衰老凋亡的细胞杀伤清除。白细胞分化抗原CD36是清道夫受体家族成员之一，在单核细胞、内皮细胞和表皮细胞上具有免疫学功能,但在人体内仅表达于血小板上。血小板上的CD36是氧化型低密度脂蛋白的受体，其对氧化型低密度脂蛋白具有很高的亲和力。CD36基因敲除小鼠体内巨噬细胞摄取的氧化型或乙酰化低密度脂蛋白减少75%～90%[30]。也有研究表明，AGEs诱导人巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞，同时增加CD36的表达[31]。糖尿病患者的血小板具有高反应性，这与AGEs的积累有关[32]。以上研究提示，清道夫受体CD36可能与糖尿病患者血液中AGEs诱发的血小板高反应性相关。AGEs通过诱导小鼠血管内皮细胞CD36表达增加而引起血管功能障碍[33]。与正常血糖受试者相比，糖尿病患者中糖基化的CD36表达水平显著升高[34]。Zhu等[35]在糖尿病小鼠模型中发现，氧化型低密度脂蛋白通过CD36的相互作用可诱导血栓形成。AGEs或氧化型低密度脂蛋白激活的CD36诱导血小板活化，随之微血栓形成，导致糖尿病心血管并发症发生。因此，CD36过度激活可能是DbCM冠状动脉微血管病变的固有免疫反应的重要环节之一。研究表明，恩格列净可减少糖尿病大鼠心脏CD36表达，降低心脏MCP-1、肿瘤坏死因子-α和IL-6信使RNA水平[36]。由此可见，干预CD36可能影响糖尿病模型动物冠状动脉微血管功能而改变心脏功能，但仍需后续研究证实。

3.3.2干预TLR治疗DbCM TLR是单个的跨膜非催化性蛋白，可识别来源于微生物的具有保守结构的分子，是一类参与固有免疫的重要蛋白质。TLR可分两大类，第一类为内膜型，如TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR10；第二类为内体型，如TLR3、TLR7和TLR9。其中，TLR2、TLR3、TLR4和TLR6主要表达于心肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞中，并参与炎症反应。现在越来越多的研究表明，TLR是糖尿病心肌炎症反应中的关键受体。首先，机体在长期高糖条件下产生AGEs和非酯化脂肪酸等物质作为内源性配体激活TLR4，TLR4活化后与髓样分化因子88的Toll/IL-1受体同源结构域结合[37]，使得核因子κB核易位，促进基因转录[38]，导致IL-6、肿瘤坏死因子-α等表达增强，产生炎症级联反应，最终引起组织损伤。高糖可以诱导血管内皮细胞TLR4表达增加[39]。TLR2激动剂促进人血小板聚集和与内皮细胞黏附[40]。研究发现，在1型糖尿病大鼠主动脉中TLR2与髓样分化因子88表达增加，蛋白相互作用增强；与野生型组相比，糖尿病大鼠组主动脉平滑肌细胞中TLR2表达升高，血管收缩标志物增加[41]。在糖尿病小鼠中激活TLR2导致左心室舒张末期内径和收缩末期内径增大，而TLR2基因敲除糖尿病小鼠心肌中纤维化较DbCM小鼠下降[42]。另外，TLR4基因沉默或抑制可减少糖尿病模型小鼠心肌细胞凋亡，减轻氧化应激和炎症反应[43]；而尾部静脉注射TLR4干扰小RNA可减轻糖尿病导致的炎症介质和黏附分子过表达，改善左心室缩短分数和射血分数[44]。研究显示，人参皂苷和紫檀烯可降低糖尿病大鼠心肌组织TLR4、NLR蛋白(NLR protein,NLRP)3和炎症介质蛋白水平，改善其心功能[45-46]。敲除TLR6可抑制核因子κB的转录活性，明显减轻心肌纤维化[47]。Gao等[48]发现，体内特异性敲除心肌细胞Yes原癌相关基因后，大多数TLR表达和促炎性细胞因子分泌增加。总之，TLR2、TLR4、TLR6等均有可能在心肌细胞和血管内皮细胞的细胞膜上参与固有免疫应答。

3.3.3干预NLR治疗DbCM NLR是细胞质蛋白家族，是一类重要的胞内识别受体。NLR主要表达于单核巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和内皮细胞。NLRP1、NLRP2和NLRP3为典型的NLRP，一旦激活则磷酸化核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶引起细胞凋亡。NLRP2基因敲除可抑制糖尿病大鼠心肌纤维化和心肌细胞凋亡[49]。激活后的胱天蛋白酶1介导IL-1β前体和IL-18前体切割活化成IL-1β和IL-18并释放到细胞外,促使组织细胞的炎症坏死[50]。研究证实,高血糖可作为刺激信号,诱导NLRP3的装配及活化[51]。高糖等外界刺激使活性氧急剧增加,机体抗氧化的能力相对不足,引起活性氧大量集聚。受损线粒体释放的线粒体DNA片段和活性氧作为危险信号活化NLRP3[52]。氧化型低密度脂蛋白刺激后，人脐静脉内皮细胞NLRP3水平上调[53]。在糖尿病大鼠心肌匀浆中，IL-1β、NLRP3水平显著上调[54]。沉默NLRP3基因后糖尿病大鼠心肌中活化的胱天蛋白酶1和IL-1β水平降低，心肌纤维化减轻，左心室收缩舒张功能障碍减轻[55]。MCC950(一种NLRP3小分子抑制剂)可明显抑制糖尿病小鼠主动脉粥样硬化病变，减少炎症反应，改善血管功能[56]。在DbCM模型大鼠心肌中可见NLRP3、胱天蛋白酶1过表达,当敲除大鼠NLRP3时,大鼠心肌纤维化减少,心功能明显改善[57]。有研究发现,沉默糖尿病大鼠心肌细胞硫氧还蛋白相互作用蛋白可以抑制NLRP3的活化,缓解高糖导致的细胞损伤[58]。与NLRP1和NLRP2相比，NLRP3是研究更为广泛的胞内模式识别受体，然而这些受体蛋白在心肌细胞还是血管内皮细胞表达或发挥作用尚不确定。

4 小 结

心脏微血管炎症导致的微循环障碍是DbCM发生和发展的关键因素之一。减轻心脏微血管炎症在一定程度上可延缓DbCM进程。干预MCP-1、CCR2、CXCR4、TLR和NLR等均可改善实验性糖尿病动物的心功能。干预固有免疫的部分环节可有效治疗DbCM。黏附分子、趋化因子与趋化因子受体、模式识别受体等可表达于心脏微血管内皮细胞或单核巨噬细胞胞膜，而CD36表达于血小板，它们均参与微血管内或血管周围的固有免疫反应。另外，TLR同时在心肌细胞和成纤维细胞上表达，而NLR也可以表达于单核巨噬细胞，两者是否参与心肌细胞的固有免疫反应尚不清楚。因此，干预上述固有免疫环节是否依赖于改善微血管炎症治疗DbCM有待进一步证实。