肝脏疾病细胞铁死亡研究进展*

薛 旗，徐琊芸 综述，李 婕 审校

慢性肝病是指各种原因导致的慢性肝脏损伤，其发病原因较复杂，乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、代谢紊乱、饮酒等导致的病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)和酒精性肝病及其相关肝硬化、肝癌是我国主要的慢性肝病。我国脂肪性肝病发病率近30%[1]，病毒性肝炎患病人数达9000万人[2]，酒精性肝病病人接近6200万人[3]。因此，慢性肝病发病率极高，是殃及我国近5亿人的重大公共健康问题。但目前关于慢性肝脏疾病的具体发病机制尚不清楚。铁死亡(ferroptosis)是一种铁依赖性的，脂质过氧化诱导的，区别于细胞坏死、自噬等细胞死亡的新型的程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)方式[4]。铁死亡在多种疾病，包括肿瘤、炎症的发生发展中发挥重要作用。近期越来越多的研究成果证明铁死亡在慢性肝病的发生发展过程中亦发挥着重要作用。

1 铁死亡概述

1.1 铁死亡的定义 铁死亡最早于2012年被正式提出并命名，发现小分子化合物erastin触发了一种独特的铁依赖性非凋亡性细胞死亡形式，erastin通过抑制胱氨酸向细胞内转运，进而导致谷胱甘肽(glutathione，γ-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)降低和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的失活，最终诱导细胞发生死亡[5]。

1.2 铁死亡的特征 铁死亡时超微形态学特征表现为细胞膜断裂和出泡，线粒体萎缩、线粒体脊减少甚至消失、膜密度增加、细胞核形态正常，但缺乏染色质凝集；电镜下观察到胞内线粒体变小、膜密度增高[6]。铁和活性氧(reactive oxygen species，ROS)聚集，激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)系统，通过降低胱氨酸的摄取、耗竭谷胱甘肽，抑制谷氨酸/胱氨酸反向转运体(glutamate/cystine transporter又称 Xc antiporter system, system Xc-)和增加还原型酰腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，释放花生四烯酸等介质是其主要的生物学特征[7]。

铁死亡在基因水平上主要受核糖体蛋白L8(ribosomal protein，RPL8)、铁反应元件结合蛋白2(iron responsive element binding-protein 2，IREB2)、三四肽重复结构域35(tetratricopeptide repeat domain 35，TTC35)、柠檬酸合成酶(citrate synthase，CS)、酰基辅酶A合成酶家族成员2(acyl-CoA synthetase family member 2，ACSF2)的调节，代谢、储存相关基因TFRC、ISCU、FTH1、FTL也参与其调控过程[5]。

1.3 铁死亡的机制 在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，即发生细胞内脂质氧化物代谢障碍，脂质活性氧堆积，细胞抗氧化能力减弱，进而诱导细胞死亡；此外，还表现为抗氧化体系(主要是谷胱甘肽系统)的调控核心酶GPX4的降低。GPX4和systemXc-被认为是介导铁死亡通路的关键因子。具体调节机制表现为以下几个方面：①抑制GPX4从而诱导铁死亡：GPX4能降解小分子过氧化物和某些脂质过氧化物，抑制脂质过氧化。研究发现，若细胞中GPX4表达下调则会对铁死亡更敏感；相反，若上调GPX4的表达，则会产生对铁死亡的耐受。因此，将GPX4抑制后将诱导细胞发生铁死亡[8]。②抑制systemXc-从而诱导铁死亡：system Xc-主要介导谷氨酸与胱氨酸以1:1比例交换，胱氨酸转运到细胞内，同时排出细胞内的谷氨酸；随后，胱氨酸可以转化为半胱氨酸，用于内源性抗氧化剂GSH的合成；最后，GPX4 利用GSH清除细胞内过量的ROS[9]。③铁离子输入与铁离子还原会诱导铁死亡：向细胞中输入铁离子，并且保证铁离子以二价铁的形式大量存在会诱导铁死亡，二价铁离子通过芬顿反应可启动脂质体过氧化[5]。

2 铁死亡与肝脏疾病的关系

近年来研究表明铁死亡与多种疾病相关，包括癌症[10]、神经退行性疾病[11]和急性肾损伤[12]。此外，铁死亡的失调也与各种肝脏疾病相关，抑制铁死亡可以阻止肝脏疾病，如NAFLD的病理生理学进展，加强铁死亡则可促进索拉非尼诱发的细胞死亡进而为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的联合治疗提供帮助[13]。

2.1 铁死亡与NAFLD NAFLD是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关。包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)及其相关肝硬化。早期单纯性脂肪变性通常被认为是良性的，而晚期NASH则更具攻击性，表现为肝细胞死亡和进展为肝纤维化、肝硬化和HCC[1]。铁死亡可能是NASH炎症反应的重要触发因素，通过胆碱缺乏和乙硫氨酸补充(choline-deficient and ethionine-supplemented，CDE)饮食建立NASH小鼠模型，观察到小鼠在发展为NASH的起始阶段肝细胞铁死亡先于细胞凋亡出现，并且显示铁死亡抑制剂几乎能够完全逆转NASH初期的肝细胞死亡，抑制炎症反应和脂质过氧化反应，改善肝功能[14]。铁死亡通过调节氧化应激及其相关的脂质过氧化在NASH的发生发展中起主要作用。实验显示在用铁死亡诱导剂处理的甲硫氨酸和胆碱缺乏(methionine/choline-deficient，MCD)饮食喂养的小鼠的肝脏中发现较高的脂质积累[15]。同样在MCD建立的模型中发现小鼠肝脏内的花生四烯酸代谢上调，进而出现脂质ROS积聚，同时显著加速了NASH相关的病理改变，包括炎症反应、氧化应激和NASH早期的细胞损伤[16]。

铁伴侣蛋白多聚(rC)结合蛋白1(poly rC binding protein 1，PCBP1)可保护小鼠肝脏免遭脂质过氧化和脂肪变性[17]。作为维持肝脏铁平衡所必需的物质，PCBP1可控制小鼠肝脏中不稳定铁池(labile iron pool，LIP)的反应性，从而抑制铁介导的小鼠脂肪变性、脂质过氧化和肝细胞死亡。也有研究发现丝裂素2(mitofusin 2，Mfn2)与IRE1α(inositol-requiring enzyme 1α，肌醇需求酶1α)的相互作用可促进5-HETE的产生，最终导致砷和铁诱导的NASH，而使用铁死亡抑制剂可显著改善砷引起的铁超载、炎症反应和脂质积聚，使NASH明显减轻[18]。发现在高脂肪饮食(high fat diet，HFD)诱导的ApoE-/-小鼠体内和体外实验中，银杏内酯B可能通过核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)信号通路对NAFLD脂质过氧化和氧化应激引起的铁死亡有抑制作用，通过调节相关蛋白(GPX4、HO-1、TFR1和FTH1)的表达而调节代谢，抑制氧化应激及肝脏脂质过氧化[19]。

2.2 铁死亡与病毒性肝炎 有研究发现血清铁调素及其铁代谢相关指标是评估慢性乙型肝炎严重程度的重要指标[20]，亦有学者提出血清铁水平可以作为判断慢性乙型病毒性肝炎转归和预后评估指标[21]。以往的实验已经证实乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)可通过调节各种信号通路使肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)激活而诱导肝纤维化。研究发现大黄酚在HBx存在的情况下增加脂质ROS的产生和内质网应激标志物及铁死亡标记物的表达上调，表明大黄酚可通过诱导铁死亡而显著诱导HBx转染的HSC死亡，从而抑制HSC增生和分泌细胞外基质，以预防肝纤维化[22]。

2.3 铁死亡与药物性肝损伤 药物性肝损伤是急性肝功能衰竭的主要病因，由药物引起的肝细胞死亡也有多种方式，其中铁死亡在药物性肝损伤中的作用机制吸引众多研究者的关注。有实验表明，在抗结核药物的代谢过程中，大量细胞内GSH和GPX4被耗尽，而活性氧和细胞铁含量均增多，补充GSH可显著降低脂质过氧化水平和肝损伤风险，补充铁则增强异烟肼和利福平诱导的脂质过氧化和肝损伤的程度，证实在抗结核药物导致的药物性肝损伤期间出现的脂质过氧化和铁死亡[23]。APAP诱导的肝毒性、脂质过氧化和铁死亡标记基因的上调被Fer-1和铁螯合剂显著阻止也证实该结论[24,25]。(+)-黄皮酰胺则可通过抑制肝细胞铁死亡来改善药物性肝损伤，实验证明(+)-黄皮酰胺可增加肝细胞中GPX4的蛋白水平，还能够激活Keap 1-Nrf 2途径，抑制药物诱导的肝细胞铁死亡[26]。

2.4 铁死亡与酒精性肝病 对肠道特异性SIRT1缺失(SIRT1iKO)的基因敲除小鼠和慢性过量乙醇喂养的小鼠进行乙醇喂养研究，结果发现，乙醇给药后SIRT1iKO小鼠的肝脏炎症和肝脏损伤指标比对照小鼠显著减轻，SIRT1iKO 小鼠的这种保护作用可能是由于减轻铁代谢功能障碍而造成，证明肠道SIRT1缺乏通过减轻铁死亡从而保护小鼠免受酒精性肝损伤[27]。还有研究者对lipin-1过表达转基因(Lpin1-TG)和野生型(WT)小鼠使用慢性过量乙醇喂养方案，在慢性酒精过量攻击后，Lpin1-TG小鼠表现出比WT小鼠更明显的脂肪变性、炎症加剧、血清肝酶升高、肝胆损伤和纤维化反应，小鼠脂肪组织lipin-1的过度表达促进肝脏铁沉积症的发生，后在酒精暴露下诱导小鼠铁死亡性肝损伤[28]。

2.5 铁死亡与肝纤维化 当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，HSC被激活，通过增生和分泌细胞外基质进而促进肝纤维化。以往的实验证实诱导活化的HSC死亡可能是逆转肝纤维化的关键。越来越多的研究结果表明，细胞铁死亡在肝纤维化的发生和发展中起着重要作用。RNA结合蛋白ELAVL1可通过激活铁死亡来促进HSC的死亡，erastin或索拉非尼诱导的ELAVL1上调通过与BECN1基因3’-非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)的富含AU的元件(AU-rich elements，AREs)结合而促进BECN1/Beclin1的产生，从而触发铁自噬体的生成，促进铁蛋白降解，最终导致铁超载铁死亡，进而减轻小鼠肝纤维化[29]。血红素氧合酶1(HO-1)介导的HSC铁死亡是异甘草酸镁(magnesium isoglycyr-rhizinate，MgIG)改善四氯化碳诱导的肝纤维化和HSC活化所必需的[30]。实验通过在野生型大鼠中注射50%四氯化碳来建立肝纤维化模型，发现MgIG治疗通过促进铁和脂质过氧化物的积累可显著诱导HSC铁死亡，而铁抑制素1(ferrostatin-1，Fer-1)对铁死亡的抑制完全消除MgIG诱导的抗纤维化作用。另外，实验结果也确定HO-1位于MgIG诱导的HSC铁死亡信号通路的上游位置，敲除HO-1可明显阻断HSC铁死亡，进而加重肝纤维化。同样位于HSC铁死亡信号通路上游的分子还有肿瘤抑制因子P53，发现P53依赖的HSC铁死亡对于蒿甲醚(artemether，ART)改善四氯化碳诱导的HSC活化和肝纤维化是必要的。青蒿琥酯也能通过调节铁死亡信号通路减轻肝纤维化。有研究表明ART的抗肝纤维化作用需要铁调节蛋白2(iron regulatory protein 2，IRP2)的参与，而铁死亡在此过程中起着重要作用，实验结果表明，ART可抑制IRP2与STIP1同源性和含U框蛋白1(STIP1 homology and U-box containing protein 1，STUB1)的结合，减少IRP2的泛素化，促进细胞内IRP2蛋白的积累，从而增加铁的流入，减少铁的储存和输出，细胞内铁的积累会产生过量的ROS，最终诱导HSC的铁死亡。

2.6 铁死亡与HCC 手术是HCC最主要的治疗手段，但是患者术后复发和转移发生率较高，分子靶向药物索拉非尼提供的生存益处也有限，因此，进一步了解HCC中调节性细胞死亡(regulated cell death，RCD)的分子机制已成为开发克服索拉非尼耐药性的新疗法的重要一步。与正常生理状态肝细胞相比，HCC细胞中RAS致癌基因的高表达、铁离子含量增加，脂质ROS的累积，越来越多的研究结果表明铁死亡在HCC的发生、发展中扮演着重要角色。异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)是产生NADPH的主要酶，而NADPH是线粒体GSH合成的重要来源，这启发了研究者探索IDH2敲除对体外培养的人HT1080纤维肉瘤和鼠Hepa1-6肝癌细胞以及裸鼠同种异体移植Hepa1-6细胞体内模型中铁死亡的影响。IDH2基因的下调可增强癌细胞对铁死亡的敏感性而促进铁死亡。研究表明，IDH2敲除导致肿瘤生长减少是由于GPX4抑制，最终导致细胞死亡。精氨酸修饰的囊泡状硅酸锰纳米颗粒(arginine-rich manganese silicate nanobubbles，AMSNs)可以作为肿瘤靶向治疗的铁死亡诱导剂，细胞水平结果显示AMSNs可以高效地消耗细胞内的GSH，从而抑制细胞内GPX4的活性，引起细胞内过氧化脂质的堆积，最终通过铁死亡的途径引起肿瘤细胞死亡。也有研究[30]发现p62-Keap1-NRF2抗氧化信号通路是参与HCC细胞ROS和铁死亡相关基因转录激活的关键负调节因子，结果表明，p62介导的Keap1降解导致铁死亡中NRF2活化，NRF2调节基因NQO1、HO1和FTH1通过改变铁代谢和脂质过氧化而抑制铁死亡。泛素样修饰因子激活酶1(ubiquitin-like modifier activating enzyme 1，UBA1)也通过NRF2信号转导途径通过调节Huh7表型和铁死亡参与了HCC的发展[31]。另外，Sigma-1受体(S1R)[32]也被证明是人类HCC细胞中铁死亡的负调节因子，它调节许多参与活性氧和铁代谢的靶位，以及最关键的铁死亡靶位GPX4。HIC1-HBA1和HNF4A-STMN1轴通过谷胱甘肽合成中的关键酶PSAT1反向调节GSH的产生[33]。在肝癌，铁死亡由转录的差异调节控制。研究鉴定了两类基因：铁死亡上调因子(ferroptosis up-regulated factors，FUF)和铁死亡下调因子(ferroptosis down-regulated factors，FDF)，它们通过影响GSH的合成来促进和抑制铁死亡，HBA1和STMN1为FUF和FDF的代表因子。FUF由转录因子HIC1控制，而FDF由转录因子HNF4A控制。赖氨酸-乙酰转移酶2B(lysineacetyl transferase 2B，KAT2B)通过调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化水平与肿瘤的发生发展相关，在促进铁死亡时，KAT2B的解离阻止HNF4A结合到FDF启动子，这种效应发生在KAT2B募集到FUF启动子之前，有助于HIC1结合转录FUF。破坏HIC1和HNF4A之间的平衡是用erastin处理后诱发铁死亡的先决条件，刺激HIC1的同时抑制HNF4A 11可能有助于肝癌的治疗。

3 小结与展望

铁死亡参与多种肝病的发生和发展机制。铁死亡在慢性肝脏疾病发病过程中的作用机制研究非常重要，其在治疗领域的临床意义也逐渐显现出来。目前，人们对铁死亡的研究还有许多机制不明，尤其关于铁死亡与慢性肝病的临床研究相对较少，对于两者之间的关系知之甚少，例如通过抑制铁死亡治疗慢性肝病是否具有临床可行性，铁死亡在慢性肝病的疾病演变阶段，如从炎症阶段、纤维化阶段进展到肝硬化或肝癌阶段是否发挥作用等问题还有待于进一步基础和临床研究的突破。