阴道微生物与HPV感染及宫颈病变的相关性研究进展

李明蔚，王建东

(首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院妇瘤科，北京100006)

宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤[1]，严重威胁女性生命健康。持续高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是导致宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)发生以及进展为宫颈癌的必要条件，但这并不能完全解释宫颈癌前病变及宫颈癌的发病机制。HPV感染以及宫颈病变的形成和发展均是多种因素协同作用的结果，如年龄、吸烟、过早的性行为、长期使用避孕药以及免疫缺陷等[2-3]。因此，明确HPV感染和宫颈病变形成与发展的机制是推动宫颈癌前病变和宫颈癌诊治的关键。阴道微生物作为人体五大微生物组之一，是保护女性生殖道健康的重要防御系统，阴道微生物失调与细菌性阴道病(bacterial vaginosis，BV)、性传播感染、盆腔炎、早产、流产、胎膜早破等生殖道疾病有关[4-7]。BV可增加HPV感染及CIN发生的风险[2]。但由于实验室技术的限制，既往对于阴道菌群的评价主要依据临床诊断标准、革兰染色评分等[8]，具有一定主观性，且无法详细阐明菌群改变与HPV感染和宫颈病变之间的具体联系。近年，随着高通量测序技术的发展，通过非培养方法实现了对阴道微生物的准确分析，为HPV感染和宫颈病变的机制研究及诊治提供了新的手段。现就阴道微生物与HPV感染及宫颈病变相关性的研究进展予以综述。

1 阴道微生物概述

阴道是女性生殖系统的门户，也是抵御多种生殖道疾病的第一道防线。阴道微生态由阴道解剖结构、阴道微生物群、宿主的内分泌系统以及阴道局部免疫系统构成，其中阴道微生物群是阴道微生态的核心部分，与机体和外在环境相互协调适应，共同维持阴道微生态的平衡[9]。

1.1阴道微生物的组成 阴道微生物由丰富的物种组成，包括细菌、真菌、病毒、支原体、原虫等，其中乳杆菌在正常阴道菌群中占主导地位，阴道中可检测到的乳杆菌包括卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌、惰性乳杆菌、阴道乳杆菌、阴部乳杆菌、德氏乳杆菌等20余种[10]。与口腔和肠道菌群不同，正常的阴道菌群常以乳杆菌中的1～2种为主，呈现低物种多样性[11]。Ravel等[12]将阴道微生物分为5种菌群类型，即CST(community state types)Ⅰ～Ⅴ，其中CSTⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ的优势菌群分别为卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、惰性乳杆菌和詹氏乳杆菌，CSTⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ这4种菌群类型广泛存在于73%的女性中，亚洲女性中CST Ⅰ 和CST Ⅲ最常见；CST Ⅳ则主要由非乳杆菌属菌群组成，群落物种多样性较强，以多种绝对或兼性厌氧菌为主，主要包括阿托波菌属、普雷沃菌属、加德纳菌属等，这种群落结构被认为与BV相关。

1.2阴道微生物的作用 阴道微生物通过维持阴道酸性环境(pH≤4.5)、抑制病原微生物生长以及激活免疫系统等维持阴道微生态平衡，达到预防病变的目的[13]，这种保护作用主要通过乳杆菌实现。乳杆菌可通过分解阴道上皮细胞内的糖原产生乳酸，从而维持阴道酸性环境，而乳酸是保护女性生殖道免受病原体侵害的主要因素，其不仅可通过直接作用于宫颈、阴道上皮细胞选择性地抑制乳杆菌以外的细菌生长，还可激活细胞的自噬作用，促进细胞内病原体的自我清除[14]。在炎症反应中，乳酸还可诱导形成抗炎状态、减少炎症因子的生成与趋化、阻止病原体的传播，具有良好的抗炎效果[15]。即使少部分女性的阴道菌群并不以乳杆菌为主，但仍有其他可产生乳酸的细菌发挥保护作用，如阿托波菌、巨球型菌属和细毛菌等，因此无论菌群组成如何，乳酸对于维持阴道微生态健康均必不可少[14]。除乳酸外，乳杆菌的其他产物也具有保护作用，如过氧化氢、细菌素等均可直接杀死有害微生物[8，16]；胞外多糖、磷酸化多糖和肽聚糖还可抑制肿瘤细胞的增殖[13]。乳杆菌可与阴道黏膜的上皮细胞受体结合，产生占位效应，通过竞争机制阻止病原微生物的黏附[17]。此外，乳杆菌还可激活阴道的局部免疫系统，一方面促进T细胞的增殖和分化，另一方面作为免疫增敏剂增强B细胞的免疫识别、促进细胞增殖[13]。总之，无论是乳杆菌自身还是乳杆菌的产物，对女性生殖道健康均至关重要。

1.3阴道微生物的影响因素 阴道微生物的构成受多种因素影响，种族即是一个影响显著的重要因素[12，18-19]。超过80%的亚裔和白人女性的主要阴道菌群为乳杆菌(即CSTⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型)，而在西班牙裔和黑人女性中，这一比例仅约为60%，且有超过1/3的女性阴道菌群为CST Ⅳ型，导致其阴道pH值的中位数高于亚裔和白人女性[12]。虽然目前广泛认为阴道菌群以乳杆菌为主、pH≤4.5代表健康的阴道微生态，但这并不代表以非乳杆菌为主要菌群的女性菌群状态都是病态的，不同种族之间的差异还可能与遗传因素、生活环境、生活习惯等因素有关。因此，针对不同的女性人群，应制订合理的个体化菌群标准。

在女性一生中其阴道微生物均处于动态变化中，且这种变化受雌激素水平的影响。出生时婴儿从母体及外界环境中获取阴道微生物；幼儿时期其阴道呈弱碱性或中性；随着年龄增长，雌激素分泌增多、细胞内糖原累积增加，乳杆菌逐渐占据主要地位；在育龄期，受雌孕激素周期性释放的影响，菌群也会呈现波动性，当雌激素水平最低时，阴道微生物群的多样性和易变性较大，当雌激素水平达峰值时阴道微生物群最稳定[20]。这种菌群波动性主要表现为经期阴道微生物中非乳杆菌数量增加，菌群稳定性降低，有时还可能发生菌群类型转换，而在妊娠期，菌群物种多样性降低，相对更加稳定[8，21]。绝经后，女性体内雌激素水平降低，阴道黏膜变薄，上皮细胞内糖原积累减少，菌群中乳杆菌比例降低，非乳杆菌属比例升高[22]。此外，阴道微生物还会受吸烟、口服避孕药、性生活、阴道冲洗等因素影响[16，21，23]。

阴道微生物是一个易受多种因素影响的动态平衡体系，随着生理状态和外界因素变化，这一体系不断发生改变，以维持阴道微生态的平衡，但当生理状态和外界因素变化超出微生物的调节能力时，阴道微生态会遭到破坏，导致BV、假丝酵母菌阴道病以及其他病原体感染性疾病的发生，长期炎症刺激还可增加肿瘤的发生风险[24]。

2 阴道微生物检测常用的高通量测序方法

阴道菌群主要由厌氧菌组成，对分离和培养条件要求较高，传统的实验室培养技术能够培养的微生物仅占极小部分且成功率较低、耗时长，导致研究结果较局限，已逐渐被非培养技术取代。目前微生物研究中主流的测序技术是高通量测序技术，其可在短时间内对样品中的所有微生物进行基因序列测定[25]，并实现对微生物群多种类、高效率、高准确性的全面分析[26]。目前，微生物组研究中较常用的高通量测序方法主要包括扩增子测序和宏基因组测序。

2.1扩增子测序 扩增子测序是指对微生物基因组的特征性序列进行聚合酶链反应扩增和测序，并将测序结果与现有物种数据库比对，实现对样本中微生物的识别和丰度测定。原核生物的16S核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)基因和真核生物的18S rRNA、ITS基因序列不仅具有高度保守性，还具有代表物种特性的可变区，是微生物分类研究中最常用的生物标记基因。其中，原核生物的16S rRNA测序是目前应用较多的测序方法。16S rRNA测序主要用于微生物群落的物种多样性研究，目的是分析样本的物种组成与丰度信息。但仅通过16S rRNA有时难以对细菌种类进行明确鉴定，16S rRNA的准确分辨率为“属”水平，在分析时常将16S rRNA的基因序列相似度97%以上的物种归为一类，相当于“种”水平，但由于其并未对微生物基因组进行完整测序，无法直接对微生物的功能进行分析[27]。此外，测序前需要使用引物扩增，但目前尚无一种引物可适配所有原核生物的16S rRNA，导致该测序方法具有一定偏向性和不完整性，同时还可能出现非靶区扩增，因此其测序结果有时并不能完整、准确地体现微生物群落的特点[28]。但16S rRNA测序成本低，且产生的数据量相对较小、分析速度快、易进行，因此适用于大规模研究及探索性研究[29]。目前关于阴道微生物研究的大部分高通量数据来自16S rRNA测序。

2.2宏基因组测序 宏基因组概念最早由Handelsman等[30]提出，是指环境样品中所有微生物遗传物质的总和。宏基因组测序通过提取样本中的总DNA直接进行高通量测序得到样本中所有微生物的物种及丰度信息，检测结果更加全面准确，同时还可将分类学的分辨率由“属”扩展至“种”甚至“株”的水平。在进行物种研究的基础上，宏基因组测序还可结合功能基因、信号通路等数据库提供微生物潜在的功能信息，帮助研究者从多角度对微生物进行分析[31]。此外，宏基因组测序还可用于发掘未知的新物种和功能基因。但宏基因组测序范围广、技术成本相对较高，且所产生的测序结果数据量巨大、分析难度高，导致其应用受到一定限制，因此目前关于阴道微生物宏基因组的研究数据仍较少。

3 阴道微生物与HPV感染

3.1阴道微生物菌群类型与HPV感染 以乳杆菌为主导的阴道微生物是维持阴道微生态平衡的关键，也是抵御HPV等病原体感染的重要防线，微生物组成的改变可能与HPV感染的发生和持续状态相关。研究发现，与HPV阴性者相比，HPV感染者阴道微生物中乳杆菌属的比例降低，而加德纳菌、普雷沃菌、梭形杆菌属等厌氧菌以及其他病原微生物的比例则升高[22，32-36]，表明低乳杆菌状态与HPV感染高度相关。Di Paola等[33]研究显示，HPV持续感染者的菌群类型约50%为CST Ⅳ型，其中约42.9%的菌群以加德纳菌、普雷沃菌、阿托波菌和纤毛菌属为主，且这些菌属在BV中较常见。多种厌氧菌的生长可导致群落物种多样性增加，但关于HPV感染者菌群物种多样性是否会增加目前尚存在争议。有研究发现，HPV感染者物种多样性增加[2，19，34，36-37]，但也有研究未发现这种变化[23，38-41]。Di Paola等[33]和Arokiyaraj等[35]的研究均发现，HPV持续感染者的物种多样性高于HPV清除者。由此可见，阴道菌群中乳杆菌缺乏、物种多样性增加可导致机体感染HPV的风险增加，同时还可能影响机体的HPV清除速率，使HPV感染持续存在。

在乳杆菌主导的菌群中，不同类型乳杆菌对于HPV感染产生的保护作用也有所不同。其中，卷曲乳杆菌主导群落(CSTⅠ)的保护效力最强，与较低的HPV感染率相关[14，42]，这可能是因为卷曲乳杆菌具有显著的自噬激活能力，且可分泌乳杆菌上皮黏附素、抑制加德纳菌等细菌黏附[14，43]，导致菌群稳定性提高，抗感染能力增强。除低乳杆菌群落外，以惰性乳杆菌为主导的微生物群落与HPV感染的关系最密切[44]。因为惰性乳杆菌不能产生过氧化氢、右旋乳酸及黏附因子等保护性物质，同时惰性乳杆菌还可诱导白细胞介素-8分泌，影响宫颈的炎症反应，某些菌株还会影响菌群的稳定性，使菌群向CST Ⅳ型转变，导致HPV感染风险增加[19，43]。Brotman等[34]研究发现，以加氏乳杆菌为主导的菌群清除HPV的速率最高。不同种类乳杆菌对HPV感染的影响和具体作用机制仍待进一步研究明确。

3.2阴道微生物物种与HPV感染 除乳杆菌外，HPV感染和清除还与一些特定菌种有关[45]。但由于研究对象和研究方法不同，得出的结论也并不完全一致。研究发现，与HPV阴性者相比，HPV感染者阴道菌群中的加德纳菌、普雷沃菌属、纤毛菌属、巨球型菌属、梭形杆菌属等细菌富集，表明这些特定的细菌与HPV感染风险增加有关，可作为HPV感染的微生物标志物，但相关的作用机制目前尚未明确[22，36-37]。Di Paola等[33]研究发现，与HPV清除者相比，持续HPV感染者中阿托波菌属和唾液酸酶编码基因显著富集，因此阿托波菌属和唾液酸酶编码基因可作为HPV持续感染的生物学标志。唾液酸酶由加德纳菌及普雷沃菌、拟杆菌属等厌氧菌产生，可破坏阴道上皮的保护性黏液层，协助细菌形成生物膜以抵抗机体免疫，而生物膜有利于HPV的持续存在[43]。虽然以上结果表明加德纳菌与HPV感染密切相关，但目前尚不能确定其在感染过程中产生的作用。另一项前瞻性研究发现，加德纳菌丰度增加可能是HPV感染的伴随效应，可协助机体诱发抗病毒免疫反应，促进HPV感染的清除[35，46]。相关特定物种在HPV感染过程中的作用和机制仍需进一步研究探讨。

4 阴道微生物与宫颈病变

4.1阴道微生物菌群类型与宫颈病变 研究发现，与无宫颈病变者相比，宫颈病变(宫颈癌前病变/宫颈癌)者阴道微生物中低乳杆菌型菌群的比例显著升高[37，42]，且与卷曲乳杆菌主导的CSTⅠ型菌群相比，阴道乳杆菌缺乏女性患宫颈病变的风险显著增加[44]。一项针对CINⅡ级患者的前瞻性研究显示，基线时阴道微生物群落以乳杆菌为主导的患者1年内病变消退的概率更高，而以乳杆菌缺乏伴随厌氧菌增多为阴道微生物群落的患者更可能发生病变的持续[47]。还有研究发现，随着宫颈病变级别的升高，乳杆菌缺乏菌群的占比也逐渐增加[37，48-49]。因此，阴道微生物群缺乏乳杆菌不仅可增加宫颈病变的发生风险，还可影响宫颈病变的自行消退，并促进其向更高级别的病变发展。此外，与持续性HPV感染相关的惰性乳杆菌主导菌群也与宫颈病变的发生有关[44]。

另外，宫颈病变发生风险升高还可能与阴道微生物群的物种多样性增加有关[48，50-51]，但物种多样性增加是否与病变严重程度相关目前尚存在争议[52]。有研究发现，宫颈病变级别越高，阴道微生物群落物种多样性越高[39-40，48，52-53]。但Chen等[37]研究发现，宫颈癌患者的菌群物种多样性显著高于癌前病变者和HPV感染者，但癌前病变者与HPV感染者之间的差异无统计学意义。还有研究显示，微生物的物种多样性增加与CIN的病变级别无显著相关性[50，54]。乳杆菌减少可引发加德纳菌及其他厌氧菌增加，进而导致菌群物种多样性增加，这种群落状态与宫颈病变的发生有关，但是否物种多样性越高越易促进病变进展目前尚无定论。

4.2阴道微生物物种与宫颈病变 有研究发现，加德纳菌、普雷沃菌、阿托波菌与HPV感染和CIN的发生相关[32-33，40，42，55]。另有研究显示，巨球型菌属、Prevotella timonensis、加德纳菌均与CINⅡ级的消退率降低有关[47]。Chen等[37]发现，CIN级别升高与加德纳菌丰度降低有关，表明加德纳菌主要与CIN的发生和持续存在有关，但并未促进CIN的进展。

此外，其他菌种也与宫颈病变的发生有关，如纤毛菌属、芽孢杆菌属、厌氧球菌属、梭形杆菌属、小杆菌属、卟啉菌属等，其中部分菌属还与HPV感染相关[32，39，53]。Mitra等[48]比较低级别鳞状上皮内病变患者与高级别鳞状上皮内病变患者的阴道菌群，结果发现，低级别鳞状上皮内病变患者样本中詹氏乳杆菌和人阴道乳杆菌富集，高级别鳞状上皮内病变患者样本中厌氧消化链球菌、四联厌氧球菌和纤毛菌属显著增多，因此詹氏乳杆菌、人阴道乳杆菌、厌氧消化链球菌、四联厌氧球菌和纤毛菌属可作为区分低级别鳞状上皮内病变与高级别鳞状上皮内病变的生物标志物。但另有研究显示，低级别鳞状上皮内病变的微生物标志物是Prevotella amnii，高级别鳞状上皮内病变的微生物标志物是Prevotella timonensis、Shuttleworthia以及链球菌科[37]。Audirac-Chalifour等[53]和aniewski等[49]认为，纤毛菌属与宫颈癌前病变密切相关，而不是宫颈癌。但Chen等[37]研究显示，纤毛菌属、芽孢杆菌属、厌氧球菌属、梭形杆菌及Porphyromonas uenonis是宫颈癌的生物标志物。目前尚未筛选出统一的微生物标志物用于区分不同级别宫颈病变。

在HPV感染导致宫颈病变发生发展过程中，除了乳杆菌减少外，其他一些物种也参与其中，这些物种可能与某一病变级别相关或在病变进展过程中发挥作用，可作为判断病变级别及病变进展风险的生物标志物。但目前关于特定物种的识别及其与病变级别的关系尚无定论，主要原因在于研究对象来自不同的国家和地区，且研究设计不同也会影响结果的一致性。横断面研究能够发现微生物与疾病之间存在的关联，但无法明确其因果关系；同时，目前对微生物在疾病发展中的纵向变化知之甚少，仍需进行更多的前瞻性研究深入探讨。因此，结合人种、地区、患者情况等影响因素，筛选个体化的微生物标志物用于临床诊治迫在眉睫。

4.3阴道微生物失调的致病机制 阴道微生物失调与HPV感染和宫颈病变的产生均密切相关。阴道微生物失调主要表现为乳杆菌缺乏伴随多种厌氧菌及其他病原体的生长，还可能出现微生物多样性增加。乳杆菌是阴道微生物发挥保护作用的关键，乳杆菌缺乏可改变阴道的酸性环境，使过氧化氢、细菌素等保护性物质减少，从而导致厌氧菌数量增加、阴道微环境对病原体的清除能力下降；而厌氧菌数量增加可导致生殖道内的促炎性细胞因子水平显著升高，引发炎症反应和免疫失调，进而导致黏膜屏障受损，同时产生唾液酸酶等物质，损伤黏液屏障和上皮细胞，有利于HPV进入，以上这些反应共同促使HPV持续性感染的形成，同时也为病变的产生创造了条件[2，43]。炎症还可造成细胞DNA损伤，但HPV致癌蛋白E6和E7可抑制细胞凋亡，促进异常细胞增殖，导致癌变发生；同时，厌氧菌还可增加生物胺的产生，而生物胺不仅可导致亚硝胺等致癌物生成增加，还可促进病原体生物膜形成，提高病原体对宿主防御系统的抵抗力[43]。有研究通过宏基因组测序分析HPV16阳性者阴道微生物在代谢功能方面的变化发现，与HPV16阴性者相比，HPV16阳性者阴道微生物区系的糖代谢、氨基酸代谢、膜转运以及信号转导等代谢途径均更丰富，这可能为HPV和其他病原体的生存提供有利的微环境，促进HPV持续感染和病变的产生[33]。另一方面，HPV感染又可通过黏膜免疫与炎症反应改变阴道黏膜环境，破坏黏膜免疫屏障，增加异常菌群的黏附、侵袭和定植，促进HPV感染及宫颈病变的发展[37，43，56]。阴道微生物影响HPV感染和宫颈病变的作用机制目前尚未阐明，具体物种在这一过程中产生的作用也仍需进一步研究明确。

5 阴道微生物治疗

阴道微生物在HPV感染及宫颈病变产生和发展过程中起重要作用，因此调节阴道微生物可能会有效防止HPV感染及宫颈病变的发生发展。单独使用乳杆菌制剂或联合抗生素应用在BV的治疗中已取得一定进展，基于乳杆菌的益生菌制剂能够帮助调节阴道微生物、恢复微生态平衡，有利于HPV感染的清除。临床研究显示，长期阴道使用鼠李糖乳杆菌和口服干酪乳杆菌均可提高HPV清除率，促进异常宫颈细胞学恢复正常[57-58]。另有研究发现，高级别鳞状上皮内病变患者于宫颈锥切术后使用阴道乳杆菌制剂可提高患者术后HPV的转阴率，表明乳杆菌制剂是一种有效的HPV治疗药物[59]。体外实验表明，乳杆菌可通过调节肿瘤细胞周期、HPV致癌基因表达、癌症相关途径及免疫反应等抑制宫颈肿瘤细胞的转移和增殖[13，33，44]，且不依赖于阴道的酸性环境[60-62]。因此，补充乳杆菌、调节阴道微生物区系或可作为一种宫颈病变的辅助疗法，但仍需在临床试验中进行验证。此外，未来还应进一步明确阴道微生物与HPV感染和宫颈病变之间的相互作用，并开发新的益生菌制剂和治疗药物。此外，有研究者首次将阴道菌群移植用于复发性BV的治疗，结果显示治疗有效，表明阴道菌群移植或可重塑阴道微生物区系，重建阴道微生态平衡[63]，这也可能成为未来研究微生物治疗宫颈病变的新方向。

6 小 结

以乳杆菌为主导的阴道微生物对于维护女性生殖道健康具有重要意义。HPV感染者及不同级别宫颈病变患者的阴道微生物组成存在差异，乳杆菌缺乏、多种厌氧菌增加的阴道微生物可能会促进HPV感染和宫颈病变的产生，且某些特定物种可能也在此过程中发挥了重要作用。因此，寻找新的微生物标志物有助于临床中识别高风险患者以实现分层诊疗，并提供潜在的治疗靶点，而恢复阴道微生物平衡可能是预防和消除HPV感染、防止宫颈病变产生和进展的有效途径。但阴道微生物与HPV感染和宫颈病变的相关性研究尚处于初级阶段，微生物标志物的识别以及微生物在病变过程中的作用机制仍需进一步研究，未来大样本、前瞻性、多组学联合的研究可更好地解决这些问题。