细胞焦亡在神经退行性疾病中的研究进展

李润琪，邹伟，刘利

(南华大学衡阳医学院 附属南华医院神经内科，湖南 衡阳 421001)

神经系统炎症是机体拮抗中枢神经系统遇到有害刺激时产生的一种免疫应答反应，其发病时常伴随慢性炎症。异常聚集的宿主蛋白沉积可通过激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体诱发机体固有免疫反应，使机体炎症损伤加重，从而导致细胞死亡[1]。细胞焦亡是由病原体或非感染因素刺激引起的一种固有免疫方式，也是一种新型程序性细胞死亡模式。细胞焦亡可破坏有利于病原体生存的微环境，通过炎症因子与细胞内容物的释放对免疫细胞进行招募并激活免疫系统以清除机体内的病原微生物[2]，但也会因为激活过度导致炎症反应加剧，造成组织器官损伤[3]。相关研究指出，细胞焦亡可参与神经退行性疾病的发生发展过程[4]，炎症介质的表达异常可促进或抑制神经退行性疾病的病变过程[5-7]。因此，靶向调节细胞焦亡可作为防治神经退行性疾病的有效手段之一。现就细胞焦亡在阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)、多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)等神经退行性疾病中的研究进展予以综述。

1 细胞焦亡

1.1细胞焦亡的发现 细胞焦亡又称细胞炎性死亡，于1992年被首次发现[8]，并在之后相关福氏志贺菌感染小鼠与人巨噬细胞的报道中相继得到验证[9-10]。研究表明，巨噬细胞被福氏志贺菌感染后发生由胱天蛋白酶(caspase)-1介导并伴随大量炎症因子释放的细胞死亡，且这种细胞死亡可通过caspase-1特异性抑制剂或敲除caspase-1基因靶向逆转[11]。这种新型细胞死亡方式除了不依赖凋亡相关蛋白caspase-3外，在形态与机制等方面也有别于已知的其他细胞死亡方式。2001年，“细胞焦亡”的概念被首次提出[12-13]。当机体遭受外界病原体感染或内源性损伤时，危险信号通过caspase-1依赖性(或caspase-4/5/11依赖性)焦亡途径诱导胞质内炎症小体形成[14-16]，一方面招募并激活下游的caspase-1 (或caspase-4/5/11)，破坏GSDMD(gasdermin D)分子内自抑制结构，导致细胞膜穿孔、细胞内外离子梯度紊乱及渗透压改变；另一方面催化促炎性细胞因子如白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18等的成熟分泌[17]，导致细胞焦亡。此外，Sarhan等[18]研究表明，caspase-8可能是调控细胞焦亡的第3种关键分子，并在耶尔森菌感染过程中观察到caspase-8诱导GSDMD切割引发的细胞焦亡现象。

1.2细胞焦亡的特征 细胞焦亡、坏死性凋亡与铁死亡均是较常见的程序性细胞死亡方式，而细胞焦亡在某些特征方面与凋亡和坏死相似。

1.2.1焦亡与凋亡 细胞膜完整性丧失是细胞焦亡区别于凋亡最显著的形态学特征[19]。当焦亡发生时，细胞出现核固缩与染色质断裂，但细胞膜却不会与凋亡时一样保持完整性并形成凋亡小体，而是在炎症小体诱导下，由caspase激活引起细胞膜成孔、细胞胀破伴细胞内容物外渗以及炎症因子释放等；同时，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸由于质膜表面的孔洞暴露于外界环境中与Annexin V染料作用发生阳性反应，而其他具有穿膜特性的染料也可渗入细胞内出现阳性染色[20-21]。

1.2.2焦亡与坏死性凋亡 与凋亡相比，坏死性凋亡和细胞焦亡均具备细胞膜成孔共性，但焦亡细胞在细胞膜成孔前存在质膜出泡并生成焦亡小体的过程，且由于细胞内容物渗出使细胞趋于扁平化，与坏死性凋亡细胞形似爆破的死亡模式不同。细胞焦亡执行蛋白GSDMD与坏死性凋亡执行蛋白混合谱系激酶结构域样蛋白在细胞膜成孔中发挥关键作用，混合谱系激酶结构域样蛋白形成的选择性离子通道可使特定离子渗入细胞，导致细胞内渗透压变化，发生膨胀破裂，而GSDMD形成的非选择性离子通道对细胞渗透压的改变缺乏实质性作用[20，22-23]。

1.3细胞焦亡的分子机制

1.3.1caspase-1依赖性经典焦亡途径 当机体遭受病原体刺激处于炎症状态时，损伤相关分子模式和病原体相关分子模式被机体细胞识别后通过激活NLRP3炎症小体发生构象变化，NLRP3炎症小体N端的PYD结构域可募集凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)并结合caspase-1前体的CARD结构域组成NLRP3-ASC-caspase-1前体复合物，然后将caspase-1前体切割成具有酶活性的caspase-1-P20活性片段[24]。一方面，caspase-1通过激活GSDMD破坏GSDMD分子内自抑制结构，促使其N端活化，诱导细胞膜穿孔；另一方面，caspase-1可识别、催化促炎性细胞因子IL-18和IL-1β成熟并分泌至胞外[25-26]。

1.3.2caspase-4/5/11依赖性非经典焦亡途径 caspase-4/5(或caspase-11) 可识别人体(或小鼠)革兰阴性菌产生的脂多糖，脂多糖与caspase-4/5/11结合发生寡聚化后直接诱导GSDMD切割并引发细胞焦亡[27]。同时，caspase-4/5/11刺激pannexin-1通道释放ATP激活嘌呤能受体P2X7，使钾离子大量外排，经NLRP3/ASC/caspase-1通路间接调控IL-1β前体和IL-18前体成熟分泌，扩大炎症反应[28]。

1.3.3caspase-8依赖性焦亡途径 有报道显示，凋亡关键分子caspase-8也参与细胞焦亡过程，在致病性耶尔森菌感染情况下，caspase-8激活与炎症细胞死亡一致，且caspase-8激活可导致GSDMD在D276位点进行分子内切割，从而生成与caspase-1激活后切割GSDMD得到相同的P30片段[29]。耶尔森菌感染可抑制转化生长因子-β活化激酶1的表达，并活化受体相互作用蛋白激酶1，而受体相互作用蛋白激酶1可通过诱导caspase-8活化直接驱动GSDMD切割生成具有活性的GSDMD-N分子，造成细胞膜穿孔；同时，caspase-8活化可促进Pannexin-1通道开放并释放大量ATP，从而激活嘌呤能受体P2X7，导致钾离子外流增加，进而间接激活下游NLRP3/caspase-1通路引起细胞焦亡[18]。

2 细胞焦亡与神经退行性疾病

神经退行性疾病是一类由脑与脊髓神经元死亡导致的主要影响患者认知与运动功能的疾病，其中先天免疫的重要组分NLRP3炎症小体参与了AD、PD等神经退行性疾病的调控，表明细胞焦亡也参与神经退行性疾病的发生发展。

2.1细胞焦亡与AD AD是一类以损害老年患者记忆、认知功能为主的渐进性不可逆性神经退行性疾病，其病理生理学机制可能与炎症反应过度激活有关[30]。β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉积形成的老年斑和由tau蛋白构成的神经原纤维缠结是AD的主要病理特征。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，参与Aβ的清除。研究发现，NLRP3、ASC和caspase-1主要在脑小胶质细胞中表达，表明NLRP3炎症小体与Aβ可能存在紧密联系[31-32]。Aβ被小胶质细胞吞噬后可诱导AD患者脑组织、脑脊液以及外周血中IL-1β分泌，同时，脑部存在Aβ斑块的小鼠以及AD患者的脑组织及神经元中的caspase-1活化片段均增加[33]。此外，中枢神经系统炎症微环境改变也会影响小胶质细胞清除 Aβ的能力[34]，即炎症可降低AD小鼠小胶质细胞对Aβ的清除能力，AD转基因小鼠海马组织过表达IL-1β可加重中枢神经系统慢性炎症反应，而敲除NLRP3或ASC可改善AD模型小鼠的老年斑沉积[35-36]。以上研究表明，Aβ与焦亡关键成分NLRP3炎症小体、IL-1β均密切相关。

还有研究发现，额颞叶痴呆患者皮质组织中的焦亡相关蛋白caspase-1与炎症因子IL-1β均高表达[37-38]。深入研究后发现，功能缺失的NLRP3炎症小体减弱tau过度磷酸化及异常聚集通过调节tau激酶和磷酸酶水平实现；向脑内注射含原纤维淀粉样蛋白Aβ的脑组织匀浆也可诱导NLRP3依赖性tau蛋白的病理改变[39]，表明炎症小体在额颞叶痴呆发展过程中具有重要作用。另有研究显示，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)与P2X7/NLRP3/caspase-1通路的激活在AD相关神经炎症发展过程中具有重要作用，即活化的P2X7受体可通过NLRP3/caspase-1通路介导神经炎症，而引发神经变性过程的关键因素是NLRP3炎症小体活化[40-41]。因此，靶向抑制NF-κB、P2X7/NLRP3/caspase-1可以为神经炎症诱导的AD患者的早期治疗提供新的临床策略。

2.2细胞焦亡与PD PD的主要特征是中脑黑质多巴胺能神经元进行性丧失与神经元内α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)异常聚集。PD的发病机制复杂，主要涉及氧化应激、线粒体功能障碍以及慢性神经炎症等。目前的证据表明，慢性神经炎症反应过度可释放大量炎症介质，从而进一步加重PD，而小胶质细胞介导的慢性无菌性神经炎症是PD发展的关键因素[42-43]。

不同来源的毒性物质均可诱导中枢神经系统小胶质细胞激活、促使神经炎症发生，进而促进多巴胺能神经元丢失与α-Syn聚集；细胞内的α-Syn释放至细胞外后通过Toll样受体/NF-κB通路激活小胶质细胞与NLRP3炎症小体，诱导细胞焦亡[44-46]。细胞焦亡过程中招募的caspase-1可诱导α-Syn聚集，从而生成以毒性α-Syn原纤维为主要成分的路易小体[47]，而路易小体的形成可导致神经元坏死与多巴胺缺乏[38]。此外，caspase-1还可催化IL-1β与IL-18成熟并分泌至细胞外，进一步损害多巴胺能神经元，促使PD的发生发展。如有研究发现，与野生型小鼠相比，NLRP3基因敲除的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-pheny 1-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)诱导的PD模型小鼠发生多巴胺能神经元丢失和小胶质细胞激活的情况有所缓解[48]，且体外实验也证实，MPTP刺激原代小胶质细胞可促进caspase-1与IL-1β的活化成熟[49]。有研究表明，敲除NLRP3或caspase-1可在一定程度上抑制鱼藤酮或MPTP诱导的小鼠PD的进展[43，50-51]，表明以NLRP3/caspase-1/IL-1β为主的细胞焦亡途径可能是加剧PD进展的危险因素。此外，许多PD患者的多巴胺能神经元中存在NLRP3高表达，且NLRP3的遗传变异性与PD风险呈负相关[52]。虽然以NLRP3炎症小体激活为主的细胞焦亡方式与PD发展过程存在相关性，且在PD患者脑部多巴胺能神经元丢失部位观察到NLRP3炎症小体激活与ASC、caspase-1表达上调[53]，但炎症小体的强效抑制剂羟基丁酸酯并不能抑制α-Syn诱导的炎症小体活化[38]。由此可见，细胞焦亡通路中的NLRP3/caspase-1/IL-1β各组分虽然可以成为PD治疗的靶点，但仍需未来大量理论数据与临床实践验证细胞焦亡与PD的关系。

2.3细胞焦亡与MS MS是一类特殊的神经退行性疾病，以中枢神经系统神经元脱髓鞘、神经胶质细胞增生以及轴突损伤为主要病理特征。辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)1和Th17细胞在MS发病过程中发挥重要作用[54]。适度的NLRP3表达有助于体内Th1和Th17细胞发育，而细胞焦亡产物IL-18和IL-1β可通过上调CD4+T相关趋化因子受体的表达促使Th1和Th17细胞向中枢神经系统迁移[55]；此外，IL-1β还可诱导粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达，进而加重神经炎症[56]，表明细胞焦亡的主要成分NLRP3炎症小体及其效应分子均参与了MS的发病过程。

研究显示，MS患者血清尿酸水平异常升高，体内高水平尿酸长期慢性刺激可诱导NLRP3、ASC、IL-18等焦亡相关因子信使RNA与蛋白表达上调，而NLRP3炎症小体被激活可促使IL-18长期处于高水平状态，从而导致持续的炎症信号通路激活与炎症因子产生[57]。此外，McKenzie等[58]研究发现，MS患者的中枢神经系统与实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型的髓样细胞(巨噬细胞/小胶质细胞)和髓鞘形成少突胶质细胞存在GSDMD介导的炎症小体激活与细胞焦亡，且caspase-1抑制剂VX-765可显著抑制EAE模型动物中枢神经系统中炎症小体和焦亡相关蛋白的表达，减轻轴突损伤，改善神经行为表现。

临床上通常采用疾病修饰治疗方式延缓MS疾病进展[59]，其中β干扰素是一种常见的一线疾病修饰治疗药物。研究表明，β干扰素仅对NLRP3依赖性EAE治疗有效，对于ASC-/-和NLRP3-/-的EAE则疗效不佳，提示β干扰素对于MS治疗的局限性取决于是否存在NLRP3炎症小体[60]。因此，NLRP3炎症小体可作为预测与诊治MS的生物标志物之一。

3 问题与展望

细胞焦亡参与神经退行性疾病发生发展的调控，靶向细胞焦亡途径的关键因子可改善中枢神经系统疾病的进展，但目前关于细胞焦亡与神经退行性疾病关系的研究仍不够深入。此外，治疗神经退行性疾病的新药研发也可从细胞焦亡途径入手，如甘草苷与雌激素受体结合可发挥雌激素样作用，从而通过NF-κB信号通路抑制细胞焦亡[61]；虫草素对脂多糖诱导的PD模型多巴胺能神经元的保护作用与抑制Toll样受体4/NF-κB/NLRP3信号通路的激活、神经炎症和细胞焦亡有关[62]。此外，格列本脲可预防百草枯暴露环境中的PD样行为也与抑制神经元焦亡有关[63]。因此，未来深入了解细胞焦亡的特征及发生机制以及神经退行性疾病的发生发展与转归，有益于临床相关疾病潜在治疗靶点的研究，同时还可为开发相关治疗药物、深入研究神经炎症在中枢神经系统疾病中的作用提供理论支持。