长链非编码RNA在肾间质纤维化中的研究进展

何婷婷，邹循亮

(遵义医科大学第五附属(珠海)医院肾内科，广东 珠海 519100)

肾间质纤维化是肾实质内瘢痕的堆积，代表几乎所有慢性和进展性肾病共同的最终途径[1]。慢性肾脏病是一种进展性疾病，一旦进展至终末期肾病需行肾透析或肾移植治疗[2]。据统计，慢性肾脏病的全球发病率约为10%[1]。因此，改善或延缓肾间质纤维化向终末期肾病进展，不仅可延长肾脏病药物治疗向肾脏替代治疗的时间，还可减轻患者家庭经济压力，节约医疗资源。但目前尚无针对肾间质纤维化的特效药物，无法逆转其进展为终末期肾病的进程。近年来，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)已成为调控基因表达、多种生物学过程的关键调控因子[3]。lncRNA可参与肾脏纤维化的炎症反应[4]、细胞增殖[5-6]、凋亡[7]等病理过程，还可与转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad3信号通路相互作用调控肾间质纤维化的进展[8-9]。此外，lncRNA还可与微RNA(microRNA，miRNA)竞争结合，共同调控肾间质纤维化的进程[10]。但目前关于lncRNA在肾间质纤维化中的研究尚不成熟。现就lncRNA在肾间质纤维化中的研究进展予以综述。

1 lncRNA概述

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的RNA，不编码蛋白质。第一个lncRNA H19于1984年由Pachnis等[11]鉴定发现。目前人类基因组中已识别出15 778个lncRNA，这些基因产生了27 908个转录本[12]。

lncRNA可作为主调控因子影响miRNA和信使RNA的表达，还可改变染色质结构。富含核的lncRNA可通过与染色质重构复合体相互作用调节同一染色体(顺式)或另一条染色体(反式)上基因的染色质结构；细胞质lncRNA可通过与miRNA反应元件交互作用调节miRNA的功能和表达，起到miRNA海绵的作用；此外，lncRNA还可靶向调节信使RNA的表达[13]。lncRNA是异质RNA，但其与编码蛋白质的信使RNA有某些相似之处，可被RNA聚合酶Ⅱ转录为类似的组蛋白修饰谱，并可进行转录后修饰，如 5′-加帽、聚腺苷酸化和剪接[14]。同时，lncRNA与信使RNA也存在差异。与信使RNA相比，lncRNA外显子和内含子较长，且无完善的蛋白质编码潜力；lncRNA的外显子较祖先重复序列更保守，其启动子较蛋白质编码基因的启动子也更保守[15]。有证据表明，lncRNA具有重要的生物学功能[16]。lncRNA参与各种重要的生物行为过程，如细胞周期控制、分化和免疫反应[17]，既具有组织特异性，又可广泛表达[18]。近年来，随着基因组学的发展以及高通量测序技术、原位杂交技术等的不断发展，lncRNA在肿瘤相关疾病中的研究更广泛，其在肾间质纤维化中的研究也逐步完善，但具体的机制目前仍未明确。

2 lncRNA与肾纤维化的相关性

既往研究表明，lncRNA在梗阻性肾病[19]、糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)[20]、晶体性肾病[21]、狼疮性肾炎[22]等疾病中的表达异常。lncRNA可通过不同途径加重或延缓肾脏疾病中相关间质纤维化的病理生理进程。

2.1调节TGF-β/Smad3信号通路 TGF-β已被公认为所有类型纤维化中的促纤维化细胞因子[23]。TGF-β/Smad3信号通过与多种lncRNA相互作用在纤维化中起重要作用。TGF-β1通过上调HK-2细胞中的lncRNA肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)的表达诱导肾纤维化[8]。lncRNA MALAT1在肿瘤细胞增殖、肌细胞生成以及突触发生中均具有重要作用[9]。Liu等[8]研究显示，单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型大鼠肾纤维化组织中的lncRNA MALAT1表达上调，TGF-β1通过上调HK-2细胞中的lncRNA MALAT1表达诱导纤维化进程，过表达lncRNA MALAT1可诱导上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、增强细胞活力、促进HK-2细胞的增殖和迁移潜力，而敲低lncRNA MALAT1则可抑制TGF-β1诱导的EMT、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积以及HK-2细胞的增殖和迁移；该研究还显示，lncRNA MALAT1可通过海绵miR-145激活黏着斑激酶的表达增强TGF-β1诱导的肾纤维化效应，提示lncRNA MALAT1/miR-145/黏着斑激酶轴参与UUO模型大鼠的肾纤维化进程。另有研究显示，lncRNA H19可下调miR-29a的表达、激活TGF-β/Smad3信号通路，从而诱导内皮-间充质转化，促进肾间质纤维化[24]。Xu等[25]研究发现，lncRNA Erbb4-IR是一种Smad3依赖性lncRNA，可通过抑制miR-29b的表达促进晚期糖基化终末产物诱导的小鼠系膜细胞和管状上皮细胞中的胶原蛋白(collagen，Col)-Ⅰ和Col-Ⅳ表达，从而导致2型糖尿病小鼠的肾纤维化。也有研究表明，lncRNA Erbb4-IR可通过下调Smad7的表达参与TGF-β/Smad3介导的肾纤维化[26]。Sun等[27]证实，被TGF-β激活的lncRNA(lncRNA activated by TGF-β，lncRNA ATB)过表达可导致人肾近端肾小管上皮细胞中的炎症因子水平升高以及细胞凋亡和衰老加重，这可能是由于lncRNA ATB过表达激活TGF-β/Smad2/3信号通路所致。此外，lncRNA TCON_00088786和lncRNA TCON_01496394被证实受TGF-β时间和剂量依赖性调控，lncRNA TCON_00088786基因下调可抑制Col-ⅠA1和Col-ⅢA1基因信使RNA的表达，而lncRNA TCON_01496394基因下调可降低结缔组织生长因子和纤连蛋白(fibronectin，FN)1信使RNA表达，提示lncRNA TCON_00088786和lncRNA TCON_01496394可促进肾纤维化[28]。

lncRNA对TGF-β/Smad3信号通路的调节不仅具有促纤维化作用，还可抑制纤维化。研究显示，在DN小鼠模型和TGF-β1诱导的HK-2细胞中，lnc-TSI(TGF-β/Smad3-interacting lncRNA)可作为内源性TGF-β1/Smad3通路的抑制剂，减少Snail1、Col-Ⅰ和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表达[29]。此外，过表达lncRNA母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)也可抑制TGF-β1诱导的表型变化、细胞活力和细胞增殖[30]。lncRNA生长阻滞特异性转录因子5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5)是一种可调节成纤维细胞激活和增殖的因子[31]。lncRNA GAS5可通过与Smad3结合抑制成纤维过程、增强金属依赖性蛋白磷酸酶1A与Smad3的结合、促进Smad3去磷酸化，从而抑制成纤维细胞的活化以及Col-ⅠA1和α-SMA的合成；此外，lncRNA GAS5过表达还可通过抑制TGF-β诱导的c-Jun氨基端激酶磷酸化减少成纤维细胞增殖[32]。还有研究发现，沉默聚集在细胞核中的lncRNA Rian，可导致Smad2、Smad3、Col-ⅠA1和α-SMA表达上调，加重肾纤维化[33]。

综上，不同的lncRNA可通过不同的作用位点调节TGF-β/Smad3信号通路，加重肾纤维化或改善肾纤维化。但过表达可抑制TGF-β/Smad3信号通路的lncRNA或敲除(沉默)可促进TGF-β/Smad3信号通路的lncRNA是否可改善或延缓肾纤维化的进展，仍需未来进一步研究探讨。

2.2调节miRNA miRNA在哺乳动物不同的生理调节过程中发挥重要作用，如控制心脏和肾脏的发育、结构和功能[34]。有研究表明，miRNA还参与纤维化等病理生理过程，可作为纤维化的促进剂或抑制剂[35]。Liu等[10]研究发现，lncRNA MALAT1可通过海绵miR-145抑制体内外纤维化模型靶基因E盒结合锌指蛋白2的表达，从而诱导内皮-间充质转化和肾纤维化。也有研究表明，Opa相互作用蛋白5反义RNA 1可通过与miR-30c-5p结合促进上皮钙黏素、神经钙黏素、TGF-β1、α-SMA的蛋白表达，加重DN的EMT和肾脏纤维化[36]。Cao等[37]通过针对UUO模型以及TGF-β诱导的HK-2细胞的体外研究发现，lncRNA浆细胞瘤变异易位1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)可通过海绵miR-181a-5p抑制miR-181a-5p对TGF-β1受体的靶向作用，导致α-SMA的表达增加和上皮钙黏素的表达降低，加重肾纤维化。Wang等[38]研究认为，lncRNA GAS5通过海绵miR-96-5p，使HK-2细胞中的FN增加，从而导致肾纤维化程度加重。Huang等[39]研究发现，LINC00667可通过调节miR-34c的表达显著抑制肾间质成纤维细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅳ的表达，降低肾间质成纤维化细胞的增殖和侵袭能力，增加细胞凋亡率，改善肾脏纤维化。Zhang等[40]研究显示，lncRNA牛磺酸上调基因1可直接与miR-29b-3p结合并作为竞争性内源性RNA发挥作用，导致由肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活诱导的肾纤维化加重，这可能与miR-29b-3p通过负调节肾脏中组织纤维化相关基因(Col-Ⅰ和Col-Ⅲ)的表达抑制部分EMT的作用减弱相关。Li等[41]通过建立体内及体外肾纤维化模型发现，lncRNA核富集转录本1(nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1)通过海绵miR-129直接抑制其与Col-Ⅰ的结合，导致肾纤维化的EMT过程和炎症反应增强。还有研究发现，lncRNA PVT1作为miR-1207-5p的海绵，与miR-1207-5p对TGF-β1、FN1表达的负性影响形成竞争关系[42]。研究证实，lncRNA 细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子2B反义RNA1过表达可与miR-424-5p竞争性结合，从而促进FN1、Col-Ⅰ和Col-Ⅳ的表达，加重肾间质纤维化[43]。Li等[44]发现，一水草酸钙可上调HK-2细胞中的lncRNA同源异形盒基因A11-反义RNA表达，lncRNA同源异形盒基因A11-反义RNA过表达可通过海绵miR-124-3p调节单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的表达抑制细胞增殖，加重细胞凋亡和细胞损伤。Wang等[45]研究证实，lncRNA牛磺酸上调基因1可通过调节miR-377靶向过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达下调线粒体生物能量学，缓解DN中的ECM积累；同时，还可通过靶向miR-21促进金属蛋白酶组织抑制剂3的表达，抑制肾脏纤维化。此外，作为miR-27a的海绵，lncRNA LINC01619也可通过激活内质网应激诱导肾纤维化[46]。

此外，lncRNA也可通过竞争性结合miRNA抑制肾纤维化。生物信息学分析、双荧光素酶报告基因检测和RNA免疫沉淀检测均证实，lncRNA 1700020I14Rik可作为内源性竞争性RNA调控miR-34a-5p的表达，缓解DN细胞增殖和纤维化[47]。Zhou等[48]发现，UUO模型中的lncRNA TCON_00088786和miR-132水平升高，沉默lncRNA TCON_00088786可降低miR-132水平，抑制间质纤维化的发展。另有研究显示，沉默UUO模型中的lncRNA同源异形盒基因转录反义RNA可上调miR-124的表达，从而缓解EMT和肾间质纤维化，表明lncRNA同源异形盒基因转录反义RNA可作为肾间质纤维化的潜在治疗靶点[49]。Ge等[50]研究显示，lncRNA GAS5可作为miR-221的内源性海绵，通过直接靶向方式和Ago2依赖方式上调沉默信息调节因子1的表达并抑制系膜细胞增殖和纤维化。还有研究发现，lncRNA GAS5可通过直接调节miR-21活性减轻肾纤维化，且血浆lncRNA GAS5水平与肾小球滤过率呈正相关，而尿GAS5水平与肾小球滤过率呈负相关，因此lncRNA GAS5可作为监测慢性肾脏病进展的替代生物标志物[51]。

以上研究表明，lncRNA可通过竞争性结合miRNA促进或抑制肾纤维化。但miRNA种类繁多，其自身即可在肾纤维化中发挥生物学效应，而miRNA与lncRNA相互作用会形成一个交织成网的复杂体系，是否可在这种复杂的关系中找到抗肾纤维化的关键节点，还需未来进一步研究探讨。

2.3调节炎症反应 炎症反应是肾间质纤维化进展的主要原因之一，抑制炎症反应可改善或延缓肾间质纤维化向终末期肾病进展，延长肾脏病药物治疗向肾脏替代治疗的时间[52]。Zhang等[4]研究显示，lncRNA LRNA9884可直接与MCP-1结合在转录水平上增强MCP-1启动子的活性，进而加重急进型炎症导致的肾损伤。Peng等[53]通过建立DN模型发现，lncRNA NONHSAG053901直接与早期生长反应因子1结合后，再与TGF-β相互作用，促进促炎细胞因子释放，加重早期生长反应因子1/TGF-β介导的肾脏炎症。另有研究证实，lncRNA MEG3通过早期生长反应因子1/Toll样受体4信号通路上调纤维化相关蛋白TGF-β1、α-SMA的表达，提高肿瘤坏死因子-α、C反应蛋白、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、MCP-1等炎症细胞因子水平，加重肾间质纤维化[54]。研究发现，lncRNA Gm4419过表达不仅可促进高糖诱导的系膜细胞ECM成分FN1和Col-Ⅳ分泌，还可促进炎症反应；lncRNA Gm4419可直接与核因子κB的p50序列相互作用，促进其从细胞质穿梭至细胞核，从而促进核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体的形成和lncRNA Gm4419转录[55]。此外，过表达lncRNA Ptprd-IR也可通过上调TGF-β1和IL-1β诱导的核因子κB驱动的促炎细胞因子的表达增强炎症反应，加重肾纤维化[56]。超声微泡在体内可有效介导lncRNA Arid2-IR(AT-rich interactive domain 2-IR)短发夹RNA的表达，加重炎症反应，而下调lncRNA Arid2-IR的表达可显著抑制UUO模型肾脏的炎症反应[57]。

lncRNA不仅具有促进炎症反应、加重肾纤维化的作用，还具有抑制炎症反应、改善肾纤维化的作用。lncRNA GAS5可通过募集Zeste基因增强子同源物2至基质金属蛋白酶9启动子区域下调基质金属蛋白酶9的表达，进而抑制肾间质纤维化和炎症[58]。目前有关lncRNA与主要抗炎细胞因子IL-10[59]及先天性淋巴样细胞[60]之间关系的研究较少。

2.4调节肾脏细胞凋亡 凋亡是所有主要类型的肾驻留细胞维持细胞内环境稳定的重要机制[61]。持续、大量的细胞凋亡可导致肾ECM沉积、肾小管上皮细胞肥大以及肾小球基底膜受损，进而导致肾小管间质纤维化[62]。Qin等[7]通过高糖诱导人足细胞CIHP-1发现，肿瘤易感性候选基因15可通过海绵miR-43c从492移位至509位，从而降低miR-43c对足细胞凋亡的抑制作用。lncRNA PVT1在DN小鼠足细胞中过表达，可促进足细胞损伤和凋亡[63]。此外，TGF-β1和FN分别被认为是纤维化发病机制中的关键细胞因子和ECM成分，PVT1上调可导致足细胞损伤和凋亡，促进TGF-β1和FN1积累[64]。DN患者的lncRNA银屑病易感相关RNA基因表达水平升高，而体外实验表明，过表达lncRNA银屑病易感相关RNA基因可降低高糖培养小鼠足细胞的活力，并增强Smad7的表达，进而促进足细胞凋亡，加重肾脏损伤和纤维化[65]。此外，在高糖培养条件下，下调lncRNA Gm5524表达和过表达lncRNA Gm15645均可诱导小鼠足细胞凋亡，降低细胞自噬[66]。lncRNA LOC105374325也可通过调节足细胞凋亡参与肾纤维化过程[67]。Shihabudeen Haider Ali等[68]研究显示，lncRNA MEG3沉默可减少其与多嘧啶结合蛋白3的结合，导致肾血管内皮细胞DNA双链断裂增加；同时，lncRNA MEG3沉默还可激活p53信号，上调p53靶基因的表达，加速肾血管内皮细胞凋亡和肾间质纤维化。

lncRNA也可抑制肾细胞凋亡，改善肾间质纤维化。Min和Xie[69]研究发现，lncRNA肿瘤易感性候选基因在DN小鼠和体外系膜细胞中过表达可调节miR-144/细胞因子信号转导抑制因子2轴，减轻DN的细胞凋亡和纤维化程度。Qin等[70]发现，铅暴露可抑制肾小管上皮细胞活力，促进细胞凋亡，同时抑制肾小管上皮细胞lncRNA Uc.173的表达，且该抑制作用具有时间和剂量依赖性，上调lncRNA Uc.173可显著抑制铅诱导的细胞凋亡。Li等[71]发现，lncRNA MALAT1靶向miR-23c可直接抑制ELAVL1(embryonic lethal abnormal vision-like 1)及其下游核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3的表达，拮抗miR-23c则可抑制其靶蛋白ELAVL1的作用，进而抑制高血糖诱导的细胞凋亡，缓解肾纤维化。Meng等[72]研究表明，lncRNA牛磺酸上调基因1可通过抑制转录因子PU.1的表达影响肾小管上皮细胞内质网应激和凋亡，改善肾间质纤维化。

综上，细胞凋亡原为细胞自我保护的主动性死亡过程，适当的凋亡有利于维持肾脏细胞内环境稳定，但过度的、持续性的凋亡则会打破内环境稳态，导致肾间质纤维化。lncRNA可直接导致(或改善)肾脏细胞凋亡，亦可作用于其他分子或通路导致(或改善)肾脏细胞凋亡，但具体的作用机制仍有待进一步研究明确。

2.5调节肾脏细胞增殖 系膜细胞异常和过度增殖均在糖尿病相关间质纤维化的病理生理过程中起重要作用[73]。因此，抑制系膜细胞的增殖在糖尿病相关肾间质纤维化的进程中尤为重要。Yang等[5]发现，UUO模型小鼠的lncRNA Arid2-IR表达较高。在小鼠系膜细胞中过表达富含AT的lncRNA有助于系膜细胞增殖，并促进ECM成分Col-Ⅰ和α-SMA分泌，共同促进肾纤维化。Li等[6]发现，lncRNA NEAT1除靶向miR-27-3p和E盒结合锌指蛋白1外，还可负调控miR-23c，而抑制miR-23c可抵消NEAT1对高浓度葡萄糖诱导的小鼠系膜细胞增殖、纤维化和EMT的抑制作用。

此外，上调lncRNA CYP4B1-PS1-001的表达可抑制小鼠肾小球系膜细胞增殖和纤维化，表现为Col-Ⅰ、G1/S期特异性细胞周期蛋白D1和成纤维蛋白的异常表达[74]。研究还证实，lncRNA CYP4B1-PS1-001在DN早期显著降低，由于lncRNA CYP4B1-PS1-001过表达可调节核苷的泛素化和降解，因此可逆转系膜细胞增殖和纤维化[75]。随着波形蛋白水平的升高和上皮钙黏素水平的降低，草酸钙诱导的HK-2细胞中的lncRNA CHCHD4P4表达上调，从而影响细胞增殖[76]。Wang等[77]研究显示，lncRNA ENSMUST00000147869在DN模型中显著下调，lncRNA ENSMUST00000147869过表达可通过调控花生四烯酸细胞色素P450ω12a基因的表达抑制系膜细胞增殖和纤维化。Chen等[20]证明，lncRNA SOX2OT可通过调节蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路介导的自噬减少DN系膜细胞增殖和纤维化。以上研究显示，lncRNA可促进或抑制系膜细胞的增殖，但lncRNA种类繁多，是否还存在其他通过调节系膜细胞增殖对纤维化形成产生负面影响的lncRNA，仍需未来进一步研究探索。

3 小 结

目前关于lncRNA在肾癌、DN、慢性肾脏病、急性肾损伤、移植物肾病等相关领域的研究已取得一定进展，通过药物或基因技术靶向特定的lncRNA也有望成为防治肾间质纤维化的新途径。但目前大多数lncRNA在肾间质纤维化中的作用机制及功能定位尚未明确，阐明具体机制仍有许多问题需要解决：①相关lncRNA是否可作为功能性RNA分子；②明确与lncRNA相互作用的蛋白质；③定义lncRNA与基因组DNA或RNA结合的位置以及细胞内的精确位置；④确定RNA-蛋白质成分整合、控制细胞功能的机制。由此可见，还应开展更深层次的基础研究，以揭示lncRNA的生物学效应，实现临床精准治疗。