抽动障碍动物模型的研究及应用

史文丽，陈慧敏，马丙祥

(1.河南中医药大学，郑州 450000； 2.河南中医药大学第一附属医院儿童脑病诊疗康复中心，郑州 450000)

抽动障碍(tic disorder，TD)是一种儿童常见的神经发育障碍性疾病，临床表现为突然、快速、反复、非节律性的运动或发声[1]。近年来，本病在全球范围发病率逐步上升[2-3]，国内最新研究显示为1%～4%，国际报道约3%，以5～7岁发病者最多，14～16岁仍有表现，30%～40%可延续至成人，对学习、生活、社交均造成危害[4-5]，由此可见TD不仅仅是一个医学问题，更逐渐成为医学背景下急待解决的社会问题。但目前TD发病因素及发病机制不明，故无特效治疗药物，且90%的患者可伴注意缺陷多动障碍、强迫障碍、自闭、焦虑、品行障碍、人格障碍及睡眠障碍等共患病[6-7]，更显疾病的复杂性[8-10]，增加治疗难度。动物模型是挑战和验证病理生理学假说的重要工具，并且在验证新的治疗方案中扮演重要角色，故关于TD动物模型的研究可提高对TD的认识和研究水平，成为探索神经精神系统与TD发病关系的关键点。然而，国内医学界对TD及其动物模型的认知非常有限，为提高通过更精确的动物模型发现疾病的病因及病机水平及加速新药研发进程，现对近年国际上TD动物模型的最新研究热点进行阐述及比较。

1 TD动物模型研究的最新热点

考虑到抽动表型的高度复杂性，动物方面通常采用哺乳动物，尤其是啮齿类动物(大鼠、小鼠、仓鼠)，同样是基于它们具有很高的成本效益和与人类神经生物学高度相似性[11]。构建的理想动物模型主要特征：表面有效性(模型行为表现与TD症状和体征的类比度)；结构有效性(TD病因、病机与模型中生物学的一致性)；预测有效性(模型对药物的反应性与患者的相似性)[12]。

表面有效性可通过观察抽动行为实现，但由于啮齿类动物的行为方式与人类截然不同，它会以重复和适应不良的方式复制有目的的行为，同时因两者的喉运动结构不同很难判断是否为发声性抽动，且无法复制先驱性冲动，故基于此评估方法的动物模型已被证实偏倚性和低可靠性[13]。

预测有效性可作为表面有效性的补充，但部分患者对任何有效的疗法均无反应，而研究者迫切通过动物模型和抽动行为验证疗法的反应性，因此会降低通过动物获取不同作用机制新型治疗方法的有效性。同时该方法需要有明确的病理生理学基础，通过美国《精神障碍诊断与统计手册》第5版中根据严重程度而并非神经生物学进行亚型分类可知目前对TD认识不足。故可解释基于此评估方法动物模型局限性的原因。

结构有效性即基于可遗传性、易感性确定相对应的内在表型，主要结合抽动表型、生物化学、神经解剖、神经心理和认知特征确定其关联性，尤其在涉及跨物种参数时(如人和啮齿类动物)更能可靠及有效地应用，故研究甚多。由上背景可见，TD动物模型的国际研究热点涉及2个：①基于基因变异和环境因素的动物模型开发，旨在复制与病因相关的关键因素；②通过表面、结构和预测有效性判断TD模型的内在表型。

2 基因模型

30多年前，TD的遗传学基础就得到了学术界的认可[14-16]，基于人群和双胞胎家庭的研究表明一级亲属患病风险显著增加[17]，8%～57%的父母有抽动病史，同卵双胞胎的患病一致率为53%～56%，而异卵双胞胎却仅有8%。既往认为TD是符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病，但二代测序检测技术的广泛应用很快修正了这一看法，提出TD是一种多基因病，并增加了大量的候选基因[18-20]，但需注意的是并非所有的基因变异都被用来建立有效的临床前模型。既往公布了第一个全基因组的关联分析，更有学者希望找到基因型与遗传方式、遗传异质性、不完全外显的关联[21]，但数据显示在不到1%的患者中发现了特定的遗传异常(包括多态性和拷贝数变异)[22-23]，并在此过程中构建了相应的基因变异小鼠，通过特定的病理生理学进行了模型验证，故基于基因技术的TD动物模型应运而生。

2.1多巴胺转运体1(dopamine transporter 1,DAT1)基因模型 DAT1基因是编码突触多巴胺含量的主要调节因子之一。DAT的主要功能是促进多巴胺重新摄取到突触前末端，因此其表达减少和功能减退会导致纹状体区突触多巴胺水平的显著提高。既往关于DAT1与TD遗传异质性关联性的研究表明，DAT1变异是易感性的潜在危险因素，基于行为学检测的小鼠研究发现了刻板行为、过度活动和注意力改变[24]。进一步的研究提示，DAT1基因敲除小鼠表现出质子泵抑制剂缺陷，此缺陷可被多巴胺D2和5-羟色胺2A血清素受体的拮抗剂以及去甲肾上腺素转运体的阻断剂抵消，并对多巴胺D1样受体阻断剂敏感。动物模型的比较研究表明，与野生型小鼠相比，DAT1缺陷小鼠表现出较低的D1受体表达和结合率。DAT1突变体小鼠因内在表型与TD最接近，是国际上最早使用且最成熟的基因模型。

2.2单胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAOA)基因模型 MAOA是5-羟色胺和去甲肾上腺素代谢的关键酶，在多巴胺降解中起重要的促进作用，而MAOA基因敲除的表型特征与TD发病机制部分吻合。既往研究表明，MAOA基因变异会增加TD的遗传易感性，人类MAOA无义突变会导致攻击行为，其启动子功能性变数串联重复多态性的低活性变异体与攻击性相关，这在早期有创伤史的男性中尤为突出。动物模型显示，MAOA转基因小鼠在环境和社会加工、自发攻击性、挑战环境时的不适应行为、重复刻板行为等方面异常[25-26]，对N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂具有高反应性，这与临床相吻合，故是继DAT1后又一热点模型。此外，MAOA基因敲除小鼠的体感皮质明显受损，这将进一步为TD患者该区域的神经解剖学研究提供依据。

2.3接触蛋白相关蛋白样2(contactin-associated protein-like 2，CNTNAP2)基因模型 CNTNAP2在细胞黏附途径和皮质发育中起关键作用，部分家族性TD患者中已确认CNTNAP2基因的变异，并且该基因的单核苷酸多态性变异与肿瘤干细胞具有关联性[27]。动物实验已证实，该基因敲除小鼠表现出抽动样、孤独症谱系障碍样和多动症表型，并有神经元迁移异常、中间神经元数量减少和神经元网络活动异常，而治疗TD临床疗效确切的利培酮可减少模型动物的高度重复刻板行为。有分子生物学研究显示，CNTNAP2基因敲除小鼠纹状体区多巴胺释放水平增加，γ-氨基丁酸能中间神经元减少，抑制信号改变，而氟哌啶醇可改善此状态[28]，故此模型可从临床表型、神经生化及结构进行复制。

2.4SLITRK基因模型 SLIT和NTRK-like均为SLITRK基因家族成员，该家族由6个编码富含亮氨酸跨膜蛋白的基因组成，参与轴突靶向和神经元分化，与皮质-纹状体-丘脑-皮质回路动态相关，并调节神经突触的生长。既往研究已证实SLITRK1为家族性TD的一个责任基因，并与共患病(如强迫症和拔毛症)及肿瘤干细胞相关[29]。小鼠动物研究显示，SLITRK1的过度表达诱导神经元生长，而家族的其他成员起到抑制生长作用，SLITRK1基因敲除小鼠显示出高去甲肾上腺素水平以及焦虑样症状，并对可乐定敏感。而SLITRK5等位基因变异度为零的小鼠纹状体细胞形态学发生改变，并表现出过度的自体生长和高度的焦虑样反应，这与眶额皮质的过度激活相关，且对由谷氨酸受体亚单位组成的氟西汀敏感。因此，国际上在研究抽动共患强迫方面常使用此模型。

2.5L-组氨酸脱羧酶(L-histidine decarboxylase，HDC)基因模型 组胺在TD病理生理学中的作用尚不清楚，但动物实验已证明该神经递质在纹状体区多巴胺能传递中发挥重要调节作用。HDC通过促进组氨酸转化为组胺，在组胺能信号转导中发挥作用。研究者在家族性TD中发现了人类发展中心基因的变异[30]，从而促成HDC基因敲除小鼠模型的制备。该模型动物被验证可表现出纹状体区多巴胺水平的升高以及高度的自发刻板行为[31]，而这些现象能被多巴胺D2受体阻断，并能被脑内组胺输注减弱。此外，在该模型中发现高密度脂蛋白胆固醇缺乏可导致小鼠质子泵抑制剂缺乏和大脑D2/D3受体结合上调[32]。HDC基因模型的造模目的和应用范围与TD基本重合，是近年国际上在基因模型领域新的研究热点。

2.6神经连接蛋白(neuroligin，NLGN)基因模型 NLGN是突触后细胞黏附分子，参与突触可塑性调节，在TD多巴胺能神经传递的调控中具有潜在意义。NLGN4基因突变体可编码神经球蛋白-4(一种突触细胞黏附蛋白)，一个罕见家族性NLGN4缺失的研究提示该基因与TD和孤独症谱系障碍有关，编码蛋白被证实与抽动样行为及早期发育阶段的社会互动缺陷相关[33]。NLGN基因敲除小鼠模型可表现出获得性重复行为，其基础是对表达D1受体的神经元突触选择性损害抑制，但腹侧纹状体和伏隔核中的D2受体没有损害[34]。一项基于神经网络的研究已证实，该模型体感皮质网络兴奋性降低[35]，但是否与体感皮质变薄有关仍须进一步研究。

2.7SAP90相关蛋白3(SAP90 associated protein 3，SAPAP3)基因模型 SAPAP3基因编码突触后致密区蛋白复合物的关键支架成分，最近的研究强调该基因是TD和强迫症的一个候选基因。SAPAP3基因敲除小鼠模型显示出过度修饰，以及许多功能和神经结构异常，通过慢病毒载体或外侧眶上纹状体回路的光遗传刺激恢复该蛋白可改善模型动物的抽动表型[36]。SAPAP3基因模型和SLITRK一样，是国际上在研究抽动共患病方面常选用的模型。

2.8D1CT-7基因模型 基于鼠遗传突变株特征的鉴定已显示该模型与TD相似，其中基于霍乱毒素胞内酶亚单位A1与人多巴胺D1受体启动子连接产生的D1CT-7转基因小鼠目前被认为是具有最高表面和预测有效性的TD模型之一[37]，因为其抽动样表现对药物治疗有反应。另一个是Hoxb8转基因小鼠，表现出皮质-纹状体-丘脑-皮质和脑干环投射神经元的显著异常，而这些特征可能与TD及相关疾病(如拔毛症)有关[38-39]。尽管这些模型的行为模式与TD相似，但是结构有效性受到质疑，因为目前缺乏这些变异病理生理学的进一步验证。如D1CT-7转基因小鼠，该突变体可于第3周出现具有性别二型性的抽动样表现(男性严重且复杂)、过度活动、跳跃、强迫或其他精神运动异常，以及D1神经元亚群的活性长期增强，且对抗精神病药物敏感。但与表面和预测有效性相反的是其人工性质和解剖定位不确定性，故如何通过质子泵抑制剂和基底神经节的神经生物学改变来评估TD主要内在表型中的结构有效性，仍有待于未来进一步探索。

3 基于环境因素暴露的动物模型

基于环境因素暴露TD动物模型的开发依赖于两种互补策略，旨在最大限度地提高结构和病因学有效性，主要体现：环境因素的复制和接触与TD的高风险相关(如产前或产后早期暴露于压力或炎症)[40-41]；通过与个体发育中涉及的主要神经递质系统相关的药理学干预来模拟TD病理生理学的特定方面。

3.1基于早期应激和产科因素模型 既往流行病学研究表明，早期暴露于一些关键环境因素可能在TD的发病机制中发挥重要作用，特别是产前和围生期有不良事件和(或)应激史的患者，发病风险明显增加[42]。产科因素、母亲吸烟与多种精神疾病有关，目前通过孕期糖尿病、子痫前期、低体重、妊娠出血、孕母营养不良、母体感染、产前压力等方式已经制备了多种多巴胺功能异常的动物模型[43]，试图复制导致其后遗症的病理生理学机制，并通过动物实验再次验证。因为多巴胺能信号的改变，大多数模型可出现显著的抽动现象学症状、刻板行为、质子泵抑制剂缺乏，但大部分还没有从TD的角度进行专科验证，故其有效性有待于进一步确定。

3.2基于早期神经炎症的模型 神经炎症[特别是产前和(或)产后早期的感染]是文献记载的最早关于环境因素的动物模型，其中最经典的是A组β溶血性链球菌(group A beta-hemolytic Streptococcus，GABHS)与TD和其他神经精神疾病之间的关系，GABHS抗体的发现更进一步验证了关联性。将TD患者血清注射到纹状体后会出现多巴胺水平和多巴胺转运体表达改变，可导致运动性及发声性抽动缓解。故基于TD患者血清和基底神经节中细胞因子含量变化，研究者已开发几种动物模型，目的是再现早期暴露于关键候选细胞因子如白细胞介素(interleukin，IL)-2和IL-6的相关表型[44]，如妊娠中期使用IL-2干预怀孕雌性小鼠会导致行为改变，IL-6干预会导致质子泵抑制剂减少，而两者可溶性受体的特定亚单位干预会导致刻板动作的多维度改变。给予患者血清和(或)GABHS抗原后的模型动物与TD神经生物学表型谱具有高度异质性[45]，这种可变性可能反映了抗体含量差异，且该模型验证的再现性差、预测有效性不确定，故之后的研究提示将GABHS暴露作为独立病因仍须探究。钾/钠超极化激活的环核苷酸通道4属于调节苍白球γ-氨基丁酸释放的通道家族，其编码基因的多态性变异与强迫症和情绪障碍有关，但一项基于啮齿动物的基础研究显示，使用环核苷酸通道4干预可使刻板动作和抽动样反应增加[46]，故环核苷酸通道4和TD之间的直接联系有待于进一步研究。

4 不同类型动物模型应用

目前越来越多的流行病学研究及环境因素暴露的队研究显示诸多因素参与TD的发生及发展，明确这些因素不仅可指导早期预防，并且对深一层次研究本病的病理生理及临床治疗有益。国内对TD的研究多局限于药理学模型[47]，但高度还原TD临床表型及发病机制的动物模型是研究本病的第一步。目前国内外仍主要使用3种有效性对动物模型进行评估[48-49]，基于表面有效性评估因人类与啮齿类动物跨物种区别不能完全呈现抽动表型(尤其发声性抽动)，基于预测有效性评估因部分动物对临床疗效确切药物仍然无效，故限制两者在实验研究中的应用。随着目前基因检测尤其是全基因组的广泛应用，大量疾病的临床表型与基因型的关联性(即内在表型)逐渐确立，故基于基因变异和环境因素暴露的动物模型因更能体现模型的结构有效性，有助于发现病理生理学变化以及内在表型，故成为动物模型首推的制备方法。并且除了特定单基因的靶向研究外，目前尚没有任何一种模型符合预测有效性。目前，环境因素暴露展现出较为典型的脑内神经递质变化，符合目前研究结果(即理论假设的脑结构及功能损伤改变)，对于研究孕期、围生期及GABHS暴露等相关病因、病机研究较为符合。其中孕期和围生期环境因素暴露模型的子鼠能确切体现多巴胺功能异常的病理生理学基础，更适合发病因素研究；GABHS暴露的神经炎症模型不仅能体现表面有效性，其脑功能及结构的异常亦符合当前的理论假设，但因对抗体含量要求高和模型复制性差，限制了其广泛应用。基因变异体对应的是不同的脑功能及脑结构异常，故基于遗传的基因模型更能明确其造模目的及药物作用靶点，能够较好地实现模型的3种有效性评估。

5 小 结

TD脑功能及结构异常、基因变异都是近年来研究者正在探索的热点领域，有利于挖掘TD发病因素及机制、验证治疗方法有效性。虽然当前尚没有完全符合3个基本有效性的理想模型，但基因模型是目前国际上TD动物模型首选及研究热点，建议结合研究目的选择合适的动物模型进行制备，除病因学外的动物实验可优先选择基因模型，以便更好地推进TD的深入研究。而如何与病理生理学及药物作用靶点结合，更精确地进行模型制备是要进一步解决的问题。