阿尔茨海默病转基因动物模型研究进展

王艳云，罗红波，叶群英

(遵义医科大学第五附属(珠海)医院神经内科，广东 珠海519000)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种以认知功能障碍及记忆力减退为主要临床表现的神经退行性变性疾病，主要的病理改变为β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉积、Tau蛋白高度磷酸化，以及它们所形成的老年斑、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。随着社会的进步与发展，AD的发病人数逐年上升，然而，目前AD的发病机制尚未完全阐明，当前被美国食品药品管理局批准上市的药物仅能轻度减轻症状或延缓病情的发展，尚无有效的预防或治疗措施。王英全等[1]报道，预测2050年AD的患病人数约为3 003万，在未来30年，中国AD的患病人数将大幅度上升。贾亚泉等[2]报道，研究者们为了进一步探究AD的发病机制及治疗药物，根据AD的发病机制假说建立了不同的动物模型，主要归为衰老模型、转基因模型、化学及物理损伤模型，其中利用转基因技术构建的转基因模型能够模拟AD的病理特征及行为表现，且具有时间和空间上的可控性，是较为理想的AD动物模型，并且转基因AD模型也是当前被研究者们广泛利用的模型。现将近年来被广泛使用的转基因AD动物模型的不同类型、特性及优缺点进行简要总结，使得研究者们能够根据其实验目的及自身情况选择适合的模型，以早日阐明AD的发病机制，研制出AD的特效治疗药物。

1 单转基因模型

尹芳等[3]报道，当前已有4个基因被广泛证明与AD的发病相关，分别是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因、早老蛋白(presenilin,PS)基因、载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因、Tau基因，据此研究者将其作为靶点，建立不同的转基因动物模型，以探究它们与AD的联系并利用其寻找AD的治疗药物。

1.1APP转基因模型 位于第21号染色体上的APP基因与早发型AD相关，其有290 000个碱基，18个外显子。高雅等[4]报道，APP经α、β和γ分泌酶剪切后形成Aβ多肽,能够生成大小不同的肽链,其中Aβ40占大部分，少数为Aβ42和Aβ43。与正常APP基因相比，其突变可裂解出更多的Aβ42片段，进一步导致Aβ沉积，甚至形成老年斑。由此推测，APP转基因AD模型具有Aβ增加及Aβ沉积的特点。

1.1.1PD APP转基因模型 Del Percio等[5]为比较两种不同的转基因AD小鼠建立了PD APP转基因模型(hAPP717v→F突变，人APP基因印第安突变:缬氨酸在残基717被苯丙氨酸取代)。Beauquis等[6]利用该模型证明了年轻的PD APP小鼠海马在出现淀粉样蛋白沉积之前的重要结构和形态，发现小鼠的海马结构、形态和突触、神经元发生改变，其海马体积减小，锥体神经元和颗粒神经元数量减少，报道了该模型小鼠5月龄时，能够检测到极低水平的脑Aβ和最小的海马Aβ沉积，以Aβ40和Aβ42为主，但是没有老年斑形成，同时在Aβ沉积前存在认知障碍和焦虑指数增加，在行为测试中，小鼠表现出新空间位置识别障碍，考虑与突触传递缺陷密切相关，此外，在实验中研究者发现星形胶质细胞减少，与一些研究者的观点相反，考虑由于应用不同方法引起。Gregosa等[7]证明了该模型鼠的大脑皮质和海马区可见淀粉样变性显著增加，且随着年龄和基因剂量的增加而增加，海马体的Aβ浓度在4～8月龄时增加了17倍，到18月龄时增加了500倍，较同月龄小鼠脑中显著增加，且沉积的Aβ绝大多数为Aβ42，10～14月龄的小鼠可观察到斑块中磷酸化的神经丝。因此，PD APP转基因AD模型是一个具有年龄依赖性Aβ42沉积的AD模型，小鼠不仅脑组织内有Aβ沉积，沉积部位以海马和皮质为主,支持APP/Aβ在AD发生中的主要作用，而且存在行为学异常表现,由于在目前研究中没有发现NFTs或成对螺旋丝形成，可将该模型作为研究Aβ相关的AD发病机制及以其作为治疗靶点的药物研究模型，或作为AD治疗药物测试的一个临床前模型。

1.1.2Tg2576转基因模型 通过构建小鼠过表达人APP的695个氨基酸同种型的突变形式(APPK670/671L)以获取Tg2576转基因AD小鼠，Zhang等[8]和Lee等[9]均证明了该模型小鼠3月龄时在空间参照和替代任务中具有正常的学习和记忆力，但是6月龄开始出现记忆丧失、认知功能减退，7～9月龄可见反应性星形细胞增多和小胶质细胞增多，9～10月龄表现出行为缺陷，Zhang等[10]在10～12月龄小鼠中观察到老年斑的形成，同样的，其Aβ沉积以Aβ42为主。Nyul-Toth等[11]最新报道了该模型小鼠存在步态功能障碍的早期表现。但是，目前尚无研究表明该模型存在Tau蛋白过度磷酸化以及NFTs形成和广泛神经元突触缺失的发生。

综上所述，Tg2576转基因模型可作为研究AD的Aβ病理学相关常用动物模型之一，用于治疗干预措施的测试。在认知功能方面，Tg2576转基因模型较PD APP转基因模型有着更明显的年龄分段，在进行行为学检测时不失为一个可选择模型。此外，目前从步态异常的角度进行人类AD研究的报道较少见，研究者可利用该模型进行行为测试或步态性能的纵向监测，以评估疾病的进展和治疗效果。

1.1.3APP23转基因模型 Sturchler-Pierrat等[12]利用人APP在670/671位点的瑞典双突变和V717I突变的2倍过度表达构建了APP23转基因模型，其是一个Aβ沉积随着年龄的增长而急剧增加的模型，在小鼠18月龄时可见新皮质和海马存在Aβ沉积及老年斑形成。此后，Inoue等[13]发现该模型鼠可见突触变性、过度磷酸化的Tau蛋白、大量丢失的神经元、脑淀粉样血管病变等病理表现，其早期内涵体改变先于淀粉样变性出现，且随着年龄的增长，空间记忆能力和认知功能下降，伴随昼夜节律和活动紊乱。Zhong等[14]在研究中发现APP23AD转基因小鼠模型呈现出多个神经元亚型特异性转录变化，这可能是未来AD研究的新方向。综上所述，APP23转基因AD模型能够模拟AD的重要病理特征，是分析APP/Aβ在AD发病机制中的理想模型之一，但该模型未观察到NFTs的形成。

1.2PS转基因模型 第14号染色体上的PS1以及第1号染色体的PS2基因在早发型家族性AD的发病中发挥着重要作用，在PS转基因AD模型中，能够观察到Tau蛋白过度磷酸化和积累，与年龄相关的神经元和突触缺失、星形胶质细胞增多症、血管病理、对兴奋性毒性损伤的易感性增加，2～4月龄的模型鼠可见Aβ42显著增加，但该模型鼠未见老年斑形成。研究者推测，PS作为一种多跨膜蛋白，能够充当部分γ-分泌酶膜内蛋白酶复合物，以水解APP，进一步产生Aβ42。因此，PS转基因AD模型即使能够观察到Aβ42显著增加、Tau蛋白过度磷酸化和积累，却没有Aβ沉积和老年斑、NFTs的形成。该模型更加适用于探究PS与APP/Aβ之间的潜在联系，以及从PS的角度出发，更深入地进行AD的治疗药物和发病机制研究。

1.3ApoE转基因模型 除了早发型AD，还存在一些晚发型AD，其与第19号染色体上的ApoE相关，也是AD的重要危险因素之一。Nuriel等[15]通过对ApoE转基因AD模型进一步研究，发现该模型鼠可观察到类AD的Aβ沉积和神经营养不良，神经元过度活跃。Liu等[16]发现其有神经突触缺失，星形细胞的ApoE4的表达增加。Zhang等[17]进一步发现有嗅觉缺失的情况。综上所述，ApoE转基因AD模型可以表现出与Aβ相关的典型表现，未见高度磷酸化的Tau蛋白和NFTs，可利用该模型探究ApoE与AD的相关性以及ApoE与APP/Aβ的联系，以探究AD的发病机制，或考虑从该方向入手进行药物研究。

1.4Tau转基因模型 定位于第17号染色体长臂(17q21)的Tau基因,含有16个外显子。马登磊等[18]报道，正常情况下，Tau蛋白是一种神经元磷蛋白，参与细胞信号转导及囊泡运输，由352～441个氨基酸组成，有促进装配轴突微管、稳定轴突微管的重要作用。当Tau蛋白与微管的结合能力降低甚至是完全不结合时，Tau蛋白将会过度磷酸化，进一步聚集形成双螺旋状细丝，发展成NFTs。因此，分布于神经元轴突中的Tau蛋白是组成NFTs的主要成分,由此推测Tau基因突变可能是导致AD的关键因素。Yoshiyama等[19]发现小鼠在没有任何运动功能障碍的情况下显示出Tau蛋白的病理改变：NFTs包裹体上的Tau蛋白高度磷酸化，以及类似双螺旋状的细丝和轻度的星形胶质改变，其海马神经元丢失和突触功能受损以及小胶质细胞活化发生在NFTs形成之前。此外，Ciupek等[20]和Gelman等[21]先后发现该模型鼠在3月龄出现学习延迟，6月龄观察到丝状Tau蛋白损伤，7～9月龄可见NFTs形成以及空间记忆能力障碍。Kreilaus等[22]发现小鼠有听觉惊吓反应的缺陷和感觉运动受损。Holton等[23]发现其有昼夜节律的改变。因此，Tau转基因AD模型的典型病理改变是Tau蛋白过度磷酸化和NFTs的形成以及行为学改变，无Aβ沉积和老年斑形成。其是探究与Tau蛋白相关的病理学研究中常用的动物模型之一，也是以Tau蛋白的病理改变为治疗靶点进行药物研究的可选择模型之一。

2 双转基因模型

2.1APP/PS双转基因模型 通过构建APP/PS1双转基因模型，Willuweit等[24]发现其可见以Aβ42为主要形式的Aβ沉积在小鼠大脑皮质和海马，且Aβ沉积远早于它们单一的转基因模型鼠，约10周大的双转基因模型鼠可见Aβ沉积在扣带皮质，3月龄可见明显增加的Aβ沉积在额叶皮质，6月龄可见大量Aβ沉积于海马体和皮质以及大脑其他区域，并伴随着老年斑形成，29月龄的小鼠Aβ沉积物数量仍在增加，此外，活化的小胶质细胞和星形胶质细胞与Aβ沉积同步增加，Faure等[25]发现海马区细胞层萎缩和神经元大量丢失；Willuweit等[24]在实验中可见神经胶质炎症和神经营养不良以及脑淀粉样血管病变。石辉等[26]利用携带与家族性AD相关的第9个外显子缺失突变的PS1dE9基因来构建APPswe(APP瑞典突变)/PS1dE9双转基因，该模型鼠于6月龄时可见脑内病理改变，但是小鼠的认知功能表现与其他基因型小鼠无明显区别，直至9月龄时出现认知行为显著异常，18月龄的模型鼠在所有认知任务中的表现均不如其他基因型小鼠，因此该转基因模型鼠脑内病理改变早于行为异常。宗园媛等[27]发现该模型小鼠3月龄时出现记忆缺陷，此时，老年斑并未完全形成，16月龄时开始出现视觉空间学习能力受损。Pugh等[28]发现该模型鼠还表现出类AD的神经精神症状，如异常运动行为、抑郁、焦虑、体重减轻、易怒和激越。张玲等[29]进一步观察该模型鼠的超微结构，发现3月龄小鼠脑组织已有线粒体和突触的损伤，6月龄小鼠出现各种细胞器损伤、微管解聚、血脑屏障损伤与细胞凋亡和自噬等明显增龄性变化趋势的超微病理改变，12月龄小鼠超微结构损伤最为严重：细胞凋亡显著增多,微管溶解,细胞器严重变性甚至出现胞质空化。Fontana等[30]建立了APP/PS2双转基因小鼠模型，在小鼠的大脑区域观察到严重的脑淀粉样变性，5月龄小鼠可见Aβ沉积及老年斑形成。秦熙和卢艳[31]则发现6月龄AD模型鼠表现出认知功能障碍,且随着病程的延长病情逐渐加重。胡沿每等[32]通过比较APP/PS1双转基因及APP单转基因小鼠，发现PS1基因的引入导致AD模型鼠的自发活动减少、速度减慢、焦虑和抑郁样行为以及认知学习和记忆功能障碍增加。综上所述，APP/PS双转基因模型综合了多种与AD发病相关的因素，能够同时模拟多种类AD的病理表现，是目前研究AD发病机制较为理想的模型，也是目前研究者广泛认可及使用较多的AD动物模型之一，研究者可根据其实验目的选择相应月龄的模型鼠。但是在该模型小鼠大脑中未见到明显的Tau蛋白磷酸化及NFTs形成，故该模型可能更多地作为淀粉样变性AD药物研究的主要模型，此外，在利用该模型进行研究时，需要考虑到该模型的外源性基因表达缺乏稳定性、造模较困难、造价相对较高。总之，该模型可为研究AD的发病机制提供新的视野,也可用于早期发现和诊断AD、监测AD疾病的进展提供帮助。

2.2APP/ApoE双转基因模型 杨勇等[33]报道，AD患者血清ApoE4明显升高，进一步研究发现，ApoE4与Aβ结合后将改变其溶解度，使得Aβ沉积增加，促进了Tau蛋白的磷酸化,最终引起NFTs形成。Zerbinatti等[34]建立APP/ApoE4双转基因AD模型发现，缺乏ApoE的PD APP小鼠的细胞内Aβ42沉积减少。Boggs等[35]发现小鼠在6月龄和12月龄表现出休息-活动周期的改变：活动延迟，黑暗早期运动较少、后期运动较多。因此，ApoE4在Aβ沉积、老年斑形成中起着重要的作用，APP/ApoE双转基因AD模型鼠能够表现出许多类AD的病理及行为学表现，但是该模型并没有观察到Tau蛋白磷酸化及NFTs形成，因此可利用该模型进一步探索ApoE对Aβ的影响，并进一步寻找ApoE对Aβ42升高的相关危险因素的预防及治疗方法，以此对AD进行药物干预研究。

2.3APP/Tau双转基因模型 Lewis等[36]将Tau转基因小鼠与Tg2576转基因小鼠杂交，成功构建出能够观察到Aβ沉积及NFTs形成的APP/Tau双转基因模型，不仅能在该模型鼠的边缘系统和嗅皮质观察到Aβ沉积，还可见神经纤维变性和大量神经元丢失。因此，APP/Tau双转基因AD模型能够模拟出Aβ沉积及NFTs形成，以及神经纤维变性和大量神经元丢失等类AD病理改变，即其综合了这两种基因突变小鼠的优点，相对地模拟出AD的两大典型神经病理改变，因此，研究者认为在AD的发病过程中，Aβ蛋白和Tau蛋白可相互促进，但其发挥作用的机制目前还未阐明。该模型可作为进一步探索AD两大主流发病假说——淀粉样级联反应和Tau蛋白磷酸化以及它们之间关系的一种模型，其也是一种较好的研究AD的模型。

3 多转基因模型

3.1APP/PS1/Tau转基因模型(3xTg-AD) AD典型的病理学特征是Aβ沉积形成的老年斑和Tau过度磷酸化形成的NFTs，为了更好地模拟出这种神经病理学表现，陈琛等[37]建立一种三重AD转基因模型——3xTg-AD，该转基因模型包含单纯的APP基因、PS1基因、Tau基因，综合单个基因突变的特点，加速了老年斑和NFTs出现的时间及程度，表现出与人类AD脑中的发育相似的时态和区域特异性特征，Aβ沉积物首先出现在皮质，并随着年龄的增长而发展到海马体，反之，Tau蛋白病理首先出现在海马体中，然后发展到皮质。随着病情的进展，3xTg-AD模型鼠的记忆和学习能力逐渐降低,炎症反应明显升高,自噬水平呈先升后降的趋势。而在早期AD病理发生前，Sterniczuk等[38]发现该模型鼠发生昼夜节律改变，Adebakin等[39]发现其甚至有较其他模型鼠更高的恐惧和焦虑水平以及食欲增加和过剩的现象。此外，Yang等[40]发现相较于雄性模型鼠，雌性表现出更显著的老年斑、NFTs、神经炎症和空间认知障碍，Kapadia等[41]发现雄性小鼠12月龄时不再表现出斑块和缠结。因此，3xTg-AD是一个能够同时表现老年斑、NFTs病理改变、学习记忆障碍、行为异常、神经精神症状的类人AD模型，其可作为临床前干预试验的一个有效工具，特别是用于评估AD的两个特征性病变所介导的神经退行性改变。然而，Fertan等[42]认为该模型虽可同时模拟老年斑和NFTs病理学改变，但其神经病理学和认知行为测试结果在各个研究中并不一致，推测可能是由于年龄和性别差异或用于测量认知功能测试难度的差异导致，因此，在对该模型的认知缺陷作评估，或利用该模型进一步研究AD的发病机制、AD的生物标志物和相关靶标分子、AD的药物干预时，均需要考虑到这些差异因素。

3.25xFAD转基因模型及5xFADxTg30转基因模型 Gu等[43]发现，带有5个家族性基因突变的APP/PS1转基因模鼠(transgenic mice with five familial AD,5xFAD)，其1月龄时表现出空间记忆功能的不足，2月龄时表现出空间学习能力不足。Girard等[44]发现4月龄时表现出早期认知障碍和海马依赖性学习记忆损伤。此外，Tang等[45]在进一步的研究中发现该模型小鼠海马的微结构完整性在早期就已经受损，随着疾病发展过程，损害变得更加广泛和严重，最终小鼠表现出空间认知行为障碍。不仅如此，5XFAD模型鼠早期存在认知相关脑区(海马和内嗅皮质)的神经元活性增加,并随疾病进展明显加重。Héraud等[46]进一步建立5xFADxTg30小鼠，其表现出更严重的运动缺陷，以及明显的海马神经元损失，随着小鼠年龄的增长，大脑中的NFTs显著增多。与此同时，Tau蛋白磷酸化水平增高，总体上更接近AD的Tau蛋白向双螺旋细丝改变的特点。因此，5转基因小鼠模型能够更真实、更细致地模拟出AD病理表现，其可作为探究AD相关病理机制及治疗的有效工具之一，但该模型造价昂贵，建模成功需要技术及能力支持，有一定的失败率及成功率，目前暂不将其纳入主要选择的模型对象。

4 小 结

AD是一种多基因遗传疾病，以上所述的AD转基因动物模型则是依据AD的神经病理学特征所建立的，建模后的小鼠可见类AD的病理学改变：Aβ沉积、老年斑形成、Tau蛋白磷酸化、NFTs形成、神经元丢失、神经胶质细胞增殖、认知功能障碍、精神行为异常等。就目前主要的AD转基因小鼠模型来看，相比较而言，采用双基因或多基因动物模型较单基因模型模拟得更全面，也更接近人类AD的病理改变及临床表现，但仍不能与自然形成的AD病理改变及临床表现一致。通过比较可以发现各个建模方法均有其相应的适用范围及利弊，每位研究者可在进行实验研究时需要根据自己的实验目的，结合自身情况科学地选择相应的建模方法。