中性粒细胞胞外诱捕网与急性肾损伤研究进展

熊号峰，刘景院

(国家传染病医学中心 首都医科大学附属北京地坛医院重症医学科，北京 100015)

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞在各种刺激因素作用后释放的一种网状纤维结构，可以直接捕获微生物发挥生理作用[1]。研究发现，NETs如果生成过多或没有及时清除，还可能引发系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相关性小血管炎、类风湿关节炎、囊性纤维病和癌症等疾病[2]。NETs和细胞外组蛋白会通过多种不同的方式影响肾脏，导致各种类型的肾脏损伤，包括急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)。AKI是指因各种原因导致肾脏功能在数小时内快速下降，主要表现为血清肌酐水平升高，进行性尿量减少或两者同时存在[3]，NETs可能通过不同的途径影响AKI的发生和发展。本综述总结了NETs不同组分导致肾脏损伤的机制，并分析了NETs与不同类型AKI发生的关系。针对NETs相关的组织损伤机制来制订治疗策略可能有助于改善肾脏疾病的严重程度。

1 NETs的形成及释放

1.1NETs、NET形成 中性粒细胞作为机体固有免疫组成部分，可通过吞噬和分泌细胞因子的方式杀灭病原体[1]。2004年，Brinkmann等[4]发现在12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇刺激下，中性粒细胞可以释放出一种直接捕获微生物的网格状纤维性结构，称为NETs。这种网状结构主要以DNA为支撑结构，其内填充颗粒蛋白和肽类等。NETs不断形成的过程也被称为NET形成，目前认为这是一种新发现的细胞死亡方式。有研究表明，胞外诱捕网也可以从其他免疫细胞释放，包括巨噬细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞和肥大细胞[5]。

1.2NETs的合成及主要组分 在12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇激活中性粒细胞后，细胞核中组蛋白在肽酰精氨酸脱亚氨酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)的作用下发生瓜氨酸化，降低了DNA和组蛋白结合的紧密强度。其后，中性粒细胞弹性蛋白酶作用于组蛋白，导致细胞核内的染色质解离[1,4]。解聚后的DNA、瓜氨酸化组蛋白和颗粒蛋白，在细胞质内合成NETs，进而释放到细胞外。NETs的主要组分为游离DNA、组蛋白、高迁移率族蛋白B1、乳铁蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、蛋白酶-3和组织蛋白酶G[6]。

1.3NETs的释放 目前已知，NETs的释放存在两种不同的方式：①中性粒细胞发生死亡，染色质及NETs相关蛋白质通过破裂的细胞膜，释放到细胞外。通常由12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、抗体、胆固醇晶体诱发，在刺激数小时后中性粒细胞死亡。②中性粒细胞不发生死亡，染色质及NETs通过囊泡排出细胞外，细胞膜重新封闭[4-6]。细胞膜保持完整，仍具有趋向性及吞噬作用。通常由金黄色葡萄球菌通过补体受体或Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)2，或通过大肠埃希菌作用于TLR4或TLR4激活的血小板诱导[7]。

2 NETs导致肾脏组织损伤的机制

尽管NETs是人体正常的先天性防御系统的一部分，但是NETs的组分可以直接或间接导致组织损伤和诱发机体自身免疫，因此NETs的过量生成或清除障碍可能对肾脏及其他脏器存在损害。研究表明，NETs具有潜在毒性，可以导致肾小球损伤[8]。中性粒细胞降解酶可导致内皮细胞凋亡，同时使基底膜发生降解。而肾小管间质损伤会导致肾小球血流量减少，从而更易产生NETs[9-11]。缺氧以及损伤可导致肾小管上皮细胞释放组蛋白，继而激化中性粒细胞生成更多NETs，并产生促炎性细胞因子释放到血液，对内皮细胞继续造成损害[8-9]。此外，NETs还可以通过激活补体的途径而发生血管损伤，并通过诱导内皮-间充质转化促进肾脏纤维化[9]。NETs相关的肾脏疾病的组织损伤介质主要包括DNA、组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、自身抗体和补体等。

2.1DNA和组蛋白 NETs的游离DNA和组蛋白可激活凝血途径，促进凝血酶生成、血小板聚集、凝血酶原活性、P-选择蛋白、磷脂酰丝氨酸和因子Ⅴ的表达而促进凝血，同时抑制纤维蛋白溶解[12]。细胞外组蛋白具有细胞毒性，可引起内皮功能障碍，导致器官功能衰竭[13]。在体外研究中，细胞外组蛋白可致使肾脏血管内皮细胞和肾小管上皮细胞死亡[14]。同时，细胞外组蛋白还可以增加活性氧的产生，可募集中性粒细胞，并可产生更多的NETs，形成了有利于NETs产生的恶性循环[15]。

2.2中性粒细胞弹性蛋白酶 Pieterse等[8]研究证明，在NETs相关的炎性疾病中，中性粒细胞弹性蛋白酶、血管渗漏和纤维化过程之间存在联系。内皮细胞的吞噬能力如果不足以处理过量形成的NETs，就会通过中性粒细胞弹性蛋白酶介导血管内皮钙黏蛋白水解，导致细胞间连接破坏而发生血管渗漏，从而在水肿和蛋白尿的发展中发挥作用。此外，还可以通过β联蛋白信号转导引起的内皮-间充质转化，内皮-间充质转化通过改变细胞形状、极性、运动性和产生胶原蛋白，可导致间质纤维化，从而促进肾脏疾病的发生和进展[16]。

2.3自身抗体 在多种肾脏疾病中普遍存在组蛋白、双链DNA和中性粒细胞颗粒蛋白等NETs组分的自身抗原。此外，ANCA的自体抗原均是NETs组分[17]。当自身无法清除与NETs相关的抗原时，炎症组织损伤后新的细胞内抗原进一步被释放，因此每次疾病发作均会引发新的自身抗体产生和组织损伤[18]。NETs也增加T细胞介导的抗原反应并激活B细胞，以诱导免疫球蛋白和抗体产生[19]。尽管自身抗体可通过多种机制引起细胞损伤和免疫激活，但免疫复合物沉积是自身抗体导致发病的重要原因，它可以激活靶细胞通过Fc受体并引起吞噬作用，导致炎症介质的释放和细胞毒性。循环中含有DNA和抗双链DNA抗体的IgG免疫复合物是导致肾炎的因素。自身抗体重链高变区尤其是高变区-3中的残基以及抗体的同种型和亚类决定了临床肾炎的风险[20]。

2.4补体系统 有研究表明，C3和C3a受体缺陷型小鼠中性粒细胞不能形成NETs，补体系统与NET形成相关[21]。通过经典或替代途径引发的补体蛋白介导的调理作用对于NETs释放至关重要。除C3外，过敏毒素C5a还通过上调TLR和补体受体来募集并激活中性粒细胞，从而增强NETs的释放[22]。

3 NETs与不同类型AKI发生的关系

NETs和细胞外组蛋白会通过多种方式影响肾脏，导致各种类型的肾脏损伤。首先，当肾脏出现感染时，NETs作为机体的一种防御因子发挥作用，同时可能会导致肾脏局部或者远隔脏器的损伤[14]。其次，NETs还可能导致各种形式的无菌坏死性炎症、促进微血管和大血管血栓形成。再次，如果NETs清除受损，机体可能产生针对NETs组分的自身免疫，例如ANCA和抗核抗体，进而导致AKI的发生。AKI的病理表现通常包括肾小管损伤、肾血管功能障碍、过度炎症和免疫细胞浸润[23]。

3.1NETs与缺血再灌注损伤导致的AKI 在缺血再灌注损伤中，NETs诱导肾小管上皮细胞死亡，通过血小板与中性粒细胞的相互作用促进肾小管周围毛细血管形成血栓，并引发其他中性粒细胞的NET形成[24-25]。有研究表明，在缺血性AKI中，可检测到循环和局部NETs和组蛋白水平的升高，同时PAD4在肾脏中的表达增加[26]。PAD4主要在中性粒细胞表达，在缺血再灌注损伤后的肾小管周围毛细血管、肾间质间隙和肾小管中聚集，在AKI发生过程中释放NETs[14]。使用药理或遗传方法抑制PAD4，减少了炎症和NETs形成，可以防止动物模型中的AKI发生；同时脱氧核糖核酸酶Ⅰ或抗组蛋白IgG促进NETs的降解也减少了肾脏损伤。这些研究均表明了NETs形成在缺血性AKI发生中的重要性[14,24]。肾小管坏死和NETs形成还可以通过释放组蛋白和细胞因子进入血液循环而加剧远端器官功能障碍，这也是严重AKI的常见特征。

3.2NETs与溶血性尿毒症综合征引起的AKI 研究表明，在溶血性尿毒症综合征引起的AKI过程中也有NETs释放，且与健康受试者相比，溶血性尿毒症综合征患者血浆中循环细胞游离DNA和核小体的含量增加[26]。NETs可促进微血管系统的炎症反应和血栓形成，导致溶血性尿毒症综合征期间的肾衰竭。

3.3NETs与ANCA相关血管炎导致的AKI ANCA是以单核细胞及中性粒细胞胞质成分髓过氧化物酶及蛋白水解酶3为靶抗原的自身抗体。ANCA相关性血管炎是一种坏死性血管炎，主要影响小血管。其以小血管坏死性炎症、大量巨噬细胞及中性粒细胞浸润为主要表现。可以累及多种器官(包括肾脏、肺、皮肤)以及外周神经系统，预后差。主要病变类型有韦格纳肉芽肿病、显微镜下型多血管炎、变应性肉芽肿性血管炎、节段坏死性星月体性肾炎，统称为ANCA相关性小血管炎[27]。

中性粒细胞可以被一系列促炎症因子(白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β和脂多糖等)刺激而处于半激活状态，中性粒细胞内蛋白水解酶3、髓过氧化物酶抗原转移至中性粒细胞表面。ANCA与蛋白水解酶3、髓过氧化物酶抗原结合后，激活了PAD4依赖的NETs释放途径[28]。此外，中性粒细胞激活后可以引起呼吸爆发，导致具有致病活性的各种蛋白酶及活性氧的大量产生，进而导致NETs的释放。氧自由基的释放可同时促进聚集的单核巨噬细胞释放炎症因子，而ANCA与中性粒细胞Fc受体Ⅲb型受体结合可以上调黏附分子，进一步促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附[19]。另外一些促炎症因子(如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)又会增加中性粒细胞中蛋白水解酶3的表达，继续与ANCA反应。ANCA介导的中性粒细胞脱颗粒后，使内皮细胞直接暴露于蛋白酶的损伤中。除此之外，ANCA可以激活内皮细胞，这些效应包括使内皮的通透性增高，使炎症细胞和血小板更易黏附于内皮细胞表面，并导致内皮细胞分泌细胞因子增多，从而导致内皮细胞损伤[29]。由此可见，ANCA及各种黏附、炎症因子与内皮细胞、中性粒细胞以及NETs之间互相影响，引起一系列免疫反应，造成持续的血管壁或组织损伤。

3.4NETs与系统性红斑狼疮性肾炎 SLE是一种以大量自身抗体形成为主要特征的自身免疫性疾病。研究显示，NETs形成过多及清除障碍可能参与SLE的发病机制，SLE患者体内的NETs水平与SLE活动度评分呈正相关[30-31]。SLE患者有独特的中性粒细胞亚群，称为低密度粒细胞，易于促炎性细胞因子释放和自发性NET形成。这些细胞刺激浆细胞样树突状细胞产生α干扰素。α干扰素对内皮细胞具有细胞毒性，可以破坏内皮细胞的分化和血管生成。因此，在SLE发作期间，α干扰素介导的对成熟内皮细胞及其前体的作用对肾脏脉管系统有害。中性粒细胞和浆细胞样树突状细胞的协同活性会通过 α干扰素放大免疫失调、炎症和组织损伤，这是SLE的重要发病机制[32]。

在NETs形成过程中，组蛋白、DNA和颗粒蛋白等自身物质大量释放，可以诱导机体产生抗NET抗体而加重患者病情。SLE患者体内的循环微粒可增强NET形成，这些微粒通常由凋亡细胞等形成。有研究表明，狼疮肾炎的活动性与循环游离DNA水平异常升高有关[33]。人体补体系统可识别和攻击SLE患者皮肤、关节、小血管、肾小球等部位沉积的免疫复合物，从而导致不同部位发生急慢性炎症反应。SLE患者血清中的NETs清除下降与肾炎活动(如蛋白尿、白蛋白水平和肌酐清除率降低)相关[32]。此外，SLE中性粒细胞产生过量的NETs与缺氧、应激反应蛋白DNA损伤诱导转录物4的上调以及自噬有关[34]。活跃的SLE中性粒细胞释放的NETs富含组织因子和白细胞介素-17A，它们可以促进包括肾脏在内的靶器官中的血栓形成、炎症、组织损伤和纤维化。

3.5NETs与血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)导致的AKI TMA是一组由自身免疫性疾病、药物、感染、妊娠等引起的以微血管血栓形成、溶血性贫血、血小板减少以及多器官受累的急性临床病理综合征[35]。一项包含90例患者的回顾性研究表明，共11例患者发展为移植相关TMA，血清NETs水平可以预测移植后发生TMA的趋势；相对于基线，移植后4周或移植当天血清NETs水平升高与移植相关TMA风险增加有关；相反，血栓调节蛋白不利于预测移植相关TMA的发生；在这项研究中，2例移植相关TMA患者的肾小球中检测到NETs沉积[36]。体外产生的NETs被健康供体的血浆有效降解。但是，NETs在接触TMA患者血浆后仍保持稳定。无法降解NETs与TMA血浆中脱氧核糖核酸酶活性降低有关。有效的NETs降解需要血浆脱氧核糖核酸酶1，TMA血浆显示该酶水平降低。用重组人脱氧核糖核酸酶1补充TMA血浆可恢复NET降解活性[37]。

4 小 结

NET形成不仅仅是一种简单的宿主免疫防御机制，同时也驱动了与无菌炎症和自身免疫有关的病理生理状况，导致各种AKI和慢性肾损伤，NET形成在肾脏损伤的发病机制和疾病进展中起着重要作用。针对NETs相关的组织损伤机制来制订治疗策略可能有助于改善肾脏疾病的严重程度。由于NETs的组分及其释放机制与每种疾病的独特发病机制有关，且同时应保持中性粒细胞介导的针对感染的免疫保护作用，因此，应针对每种疾病类型制订个性化干预措施。