Ras基因及蛋白与甲状腺癌的关系

付云平，叶晖

(1．贵州医科大学，贵阳 550001; 2．贵州医科大学附属医院甲状腺外科，贵阳 550001)

甲状腺癌为内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，从组织病理方面可分为由上皮细胞来源的乳头状甲状腺癌和滤泡状甲状腺癌，以及由滤泡旁C细胞发生的甲状腺髓样癌和具有高度侵袭性的甲状腺未分化癌，且在我国每年将以20%的速度持续增长，2020年居全球女性肿瘤发病率第5位[1-4]，其高发病率与术前分子诊断技术的提高有着密不可分的关系[5]，其中大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma virus，Ras)基因是甲状腺癌中的常见突变基因，仅次于v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源体B1(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因[6]，多见于甲状腺滤泡状癌，在甲状腺乳头状癌也有发现，且多见于滤泡亚型的甲状腺乳头状癌中[7]。Ras基因的常见位点突变多见于密码子12、13和61，异常的持续激活使编码形成RAS蛋白后激活促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路[8]。这些通路参与了细胞膜受体酪氨酸激酶信号向细胞核的传播，并调节多种细胞过程。但Ras基因在甲状腺癌中的作用机制尚不清楚。Ras基因研究结果可为甲状腺癌的诊断及风险评估提供参考，为精准医学及分子研究奠定基础[9]。现对Ras基因及蛋白与甲状腺癌的关系予以综述。

1 Ras基因的发现

Ras突变最先由Harvey[10]在白血病小鼠中发现，将含有常规传代莫罗尼白血病病毒的小鼠血浆注射到15只新生的BALB/c小鼠体内，第32天发现存活的6只小鼠中有5只在注射部位或注射部位附近长出肉瘤，从而发现了转化基因Ras。随后，Kirsten和Mayer[11]、Peters等[12]、Rasheed等[13]分别在1967年、1974年、1978年发现另外3种反转录病毒中也有Ras基因突变。Ras基因突变的亚型不同，分别以Harvey和Kirsten两人名字区分不同亚型的Ras突变，即H-Ras和K-Ras。1983年，Hall等[14]在神经母细胞瘤中发现了另一种从未在反转录病毒中发现的Ras突变，命名为N-Ras。至此人们发现了Ras基因突变的3种常见亚型。

1.1Ras基因的结构及功能 Ras基因主要存在于真核生物，其包括3种不同的类型，其中N-Ras位于第1号染色体上(1p22～p32),而H-Ras与K-Ras分别位于第11号染色体(11p15.1～p15.3)上和第12号染色体(12p1.1)上。3种亚型的Ras基因均具有5个外显子，但其中1个不参与编码蛋白。K-Ras基因由于第4外显子变异的不同分为K-RasA和K-RasB[15]，最终编码后的蛋白表达为一种高度相关的由189个氨基酸残基组成的分子量为21的G蛋白单体，也称为p21 Ras蛋白或RAS蛋白,Ras基因将编码的p21的序列都平均分配在 4个外显子上[16]。

不同亚型Ras基因在肿瘤中表达大不相同，根据癌症体细胞突变目录数据库报道，K-Ras是所有癌症中最常见的突变亚型，在结直肠癌中占主导，而在甲状腺癌中并不同，N-Ras表达高于H-Ras和K-Ras，为甲状腺癌中最常见的突变亚型，其突变的位点主要发生在密码子12、13和61。同样，不同亚型的Ras癌基因的常见突变位点也不相同，K-Ras突变位点主要是密码子12和13，N-Ras大多突变位于密码子61，低概率在密码子12和13[17]。H-Ras在密码子12的突变率最高，其次是密码子61和13。另外，学者也发现影响Ras基因其他位点的突变，但频率很低[18]。因此，这3个密码子占人类癌症所有Ras突变的92%～98%。

1.2RAS蛋白的结构及功能 RAS蛋白是一种由Ras原癌基因编码而成的含有189个氨基酸，位于细胞膜内侧与鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)结合的球蛋白，分子量为21,按照蛋白质的一级结构，从N′端开始，可分为1-85(SH1)、86-165(SH2)、166-185(SH3)、186-189(SH4)4个结构域。

其中SH1、SH2结构域氨基酸基本相同，高度保守，称为G区[19]，主要通过与GTP/鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)结合来调控信号通路，当RAS蛋白与GTP结合时处于激活状态，而与GDP结合时处于非激活态[20]，两种状态之间的转换依靠Ras-GTP酶活化蛋白和Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)的调节，Ras-GTP酶活化蛋白的作用为水解GTP,将RAS蛋白转变为与GDP结合的无效状态，与之相反，RasGEFs的作用是使RAS蛋白处于激活状态[21]。RAS蛋白作为分子开关，通过与GTP/GDP间的结合转变充当细胞内信号转导物，控制着下游信号通路[22]。

而SH3、SH4结构域处于高度可变区域，在SH4结构域的C端(186-189)中含有一个CAAX终端盒子,其中C代表半胱氨酸,A代表脂肪氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、升压素),X代表任意氨基酸，其通过C端的CAAX终端盒子与类脂结合后将RAS蛋白定位于细胞质膜上，从而引发下游通路的激活，导致肿瘤的发生和发展。

1.3Ras作用通路

1.3.1Ras/Raf/MAPK激酶(MAPK kinase，MEK)/胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路 目前，Ras/Raf/MEK/ERK信号通路为Ras基因最明确的信号转导通路，当受到膜外有丝分裂原刺激后，可导致一些整合素的持续上调，使RAS蛋白的SH2区与细胞膜表面的受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)作用，进一步通过SH3结构域与GEFs作用结合Ras-GTP，激活Ras[23-24]。活化状态的RAS蛋白刺激下游的信号因子，发生一系列级联反应，其中Raf蛋白激酶(ARAF、BRAF和CRF)是主要的RAS蛋白效应器，活化的Raf通过磷酸化MEK上的丝氨酸残基将其激活,MEK再激活ERK,进而磷酸化与胞质和胞膜相连的底物，磷酸化的ERK被激活后快速地转运入细胞核内，从而使肿瘤促进因子上调[8，25],如血管内皮生长因子、转化生长因子-β1、血小板反应蛋白1，诱导细胞从DNA合成前期(G1期)进入DNA合成期(S期)，促进细胞生长和增殖。

1.3.2PI3K-Akt通路 细胞外信号激活细胞膜上的RTK，从而导致RAS激活，随后使PI3K激活，激活后的PI3K催化4，5-二磷酸肌醇转变为3，4，5-三磷酸肌醇，3，4，5-三磷酸肌醇使磷酸肌醇依赖蛋白激酶1磷酸化后被激活，从而激活Akt,磷酸化的Akt是Akt的一种活化形式，进入细胞核可诱导肿瘤促进因子水平的上调[26]；在细胞质中，活化的Akt还可激活其他信号分子或通路，其中突出的为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路[27]，通过促进翻译在肿瘤发生中起重要意义；另外，活化的Akt还能直接使糖原合成酶激酶-3β磷酸化使其失活。正常情况下，糖原合成酶激酶-3β的作用为抑制β-蛋白，当激活的Akt使糖原合成酶激酶-3β失活后，缓解了其对β-蛋白的负向作用，导致更多的β-蛋白进入核内促进促肿瘤基因的表达。另外，激活的Akt进入核内可使叉头框蛋白O3(forkhead box O3，FoxO3)磷酸化，磷酸化的FoxO3从核内转移到胞质中，与14-3-3蛋白结合后存留在胞质中，从而终止FoxO3通路的促凋亡活性[28]。磷酸化的Akt通过以上3种途径对甲状腺肿瘤的发生提供了强大的动力。

通过以上途径，Ras基因的突变诱导了大多数肿瘤的发生，尤其是在结直肠癌、皮肤癌等肿瘤中，在结直肠癌中以K-Ras多见，而在皮肤癌则以N-Ras多见，不管是何种亚型的突变，这些机制的核心都是Ras基因出现了点突变，导致MAPK涉及广泛的二级分子改变，亦或是使Akt磷酸化激活后发生核位置的改变，而两者之间协同和放大了致癌活性，从而介导了甲状腺肿瘤发生。

2 Ras基因与甲状腺

1988年，Lemoine等[29]首次在甲状腺肿瘤中发现3种Ras癌基因(N-Ras/K-Ras/H-Ras)的激活突变，从而开始了Ras基因在甲状腺癌中的科学研究。研究表明，Ras基因突变是甲状腺癌中仅次于BRAF突变的常见突变[30]，主要发生在30%～45%的滤泡状甲状腺癌中，少数乳头状甲状腺癌中也尚有表达，但仅见于滤泡型甲状腺乳头状癌，约10%，而在经典型甲状腺癌中几乎不表达[31]。

2.1Ras基因在甲状腺结节中的诊断作用 甲状腺癌的临床治疗通常从甲状腺结节的评估开始，最常见的检测方式为超声检测。随着科学技术的不断发展、医学设备的不断完善，高分辨率超声的出现对甲状腺结节的检测率得到了大幅度的提高，而超声引导下细针抽吸活检技术进一步提高了甲状腺癌的准确度及特异度，但仍有部分结节不能明确诊断性质，对这类具有中度恶性风险的结节采纳何种治疗方案，目前仍是个难题。为解决这一难题，多项指南均提出对诊断不明确的甲状腺结节进行基因检测，因此分子分型的研究为甲状腺癌的诊断、治疗和预后评估带来了新的契机[32]。在过去的10年中，人们做出了极大的努力，将Ras突变作为诊断分子标记应用于细针抽吸活检，特别是针对细胞学不确定的结节，发现Ras突变对甲状腺癌的灵敏度和特异度较BRAF低，除在滤泡型甲状腺癌、滤泡型甲状腺乳头状癌及髓样癌中有突变外，有20%～25%的良性甲状腺滤泡性腺瘤中也发生Ras突变。Nabhan等[30]通过对多篇文献进行系统性回顾及Meta分析后发现，不管是对何种类型的Ras突变进行检测均不能对术前诊断不明确的结节提出有效的临床管理方法，甚至需要进一步的再次行基因检测或细针抽吸活检。而Ras突变作为甲状腺癌中的第二常见突变，仍是目前基因研究的重点，对Ras突变应用于甲状腺癌诊断现多是将其与其他分子标记，特别是遗传标记[BRAF、端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、PI3K等]结合使用。Rossi等[33]、Decaussin-Petrucci等[34]表示分子检测用于不确定的甲状腺细胞穿刺组织中，可增加诊断敏感性，且对不确定的甲状腺细针抽吸活检标本进行辅助分子检测的应用为患者提供了更好的分层和分类。另一项单中心研究对1 056个不确定细胞学的连续甲状腺细针抽吸活检样本进行前瞻性研究，发现多基因检测试剂盒对非典型性不确定意义/不确定意义的滤泡性病变和滤泡性肿瘤/可疑滤泡性肿瘤的结节诊断灵敏度分别达到了88%、87%。因此，多基因检测能更准确地对诊断不明确的结节进行评估[35]。目前，细针抽吸活检是术前对甲状腺结节性质进行评估的首选检查，但其仍存在一定的局限性，对于活检穿刺后意义不明确的非典型病变或滤泡性肿瘤/可疑滤泡性肿瘤的结节，若进一步行BRAF、Ras、TERT等分子检测，可为临床医师提供更多的临床证据，对指导治疗、判断预后均具有重要价值。而Ras突变是基因诊断的一个重要组成部分，更有助于提高不同类型甲状腺癌的诊断敏感性，尤其是对具有乳头样核特征的非侵袭性甲状腺滤泡性肿瘤[36]，期待随着对Ras基因的深入研究，可使含有Ras突变的基因盒剂的诊断效率得到证实和进一步提高。

2.2Ras基因突变对甲状腺癌的影响 Ras基因是甲状腺癌中仅次于BRAF基因突变的常见突变，其分子改变主要发生于第12、13、和61密码子,其中以N-Ras基因61密码子突变最常见[37]。突变后的Ras基因使编码产生的RAS蛋白持续处于活化状态。活化型RAS蛋白能够同时激活MAPK和PI3K/Akt两个信号通路，刺激细胞生长、增殖和分化阻碍细胞的凋亡，从而促进肿瘤的发生和发展。

目前认为，Ras基因是滤泡型甲状腺癌和滤泡型甲状腺乳头状癌发生的早期事件，在肿瘤的发生发展中具有重要作用。Mehrzad等[38]认为，N-Ras基因突变与甲状腺癌细胞骨转移及不良生存率有关；Chen等[39]也提出，K-Ras突变是甲状腺癌生存不良的独立预测因素，且表示Ras基因分型可能在识别与预后不良相关的甲状腺亚群方面发挥作用。尽管有研究表示，Ras基因突变可能与更差的预后和肿瘤转移倾向相关[38]，但Ras基因的预后价值也不十分明确。另有学者认为，Ras基因突变的甲状腺癌往往并不具备很强的侵袭性[40]。Insilla等[41]通过对145例分化良好的甲状腺乳头状癌患者进行TERT、BRAF、Ras检测发现，Ras突变在分化型甲状腺乳头状癌患者的侵袭性及淋巴结转移等相关临床特征方面差异无统计学意义。Kakarmath等[42]也认为,伴有Ras基因突变的甲状腺癌超声特征最常表现为阴性特征,在细胞学上也更多地提示与低风险和“不确定”的特征相关，从而疏忽甲状腺结节的恶性程度。由此可见，Ras致癌基因的突变虽然增加了肿瘤形成的风险，但具有Ras阳性的这类甲状腺癌并不属于高侵袭性肿瘤，可在适当的临床条件下采取相对保守的治疗措施。另有部分学者发现，当Ras基因与BRAF或TERT共突变时，甲状腺癌具有更高的淋巴结转移、组织侵犯、复发及恶性风险，使低风险恶性结节转变为高风险恶性结节[43-44]。Shen等[45]则更进一步指出，BRAF V600E/Ras突变共存和单独TERT突变的情况下患者预后最差；BRAF V600E和TERT突变患者情况居中；Ras单独突变和野生型患者预后最好。

综上所述，目前Ras基因对甲状腺癌的影响尚无统一定论，需要进行更多的科学研究论证，Ras基因单独突变时，由于其在不同类型甲状腺癌临床结局中的不确定作用，如何恰当地使用它们来协助评估和治疗甲状腺癌尚未明确。但当Ras与BRAF、TERT共突变时，甲状腺癌周围组织侵犯、淋巴结转移及远处转移的风险均增大，所以，术前行多基因联合检测可为甲状腺结节的恶性程度评估及治疗方案选择提供帮助。

3 Ras基因突变的分子靶向治疗

目前甲状腺癌的首选治疗方式为手术治疗，术后行促甲状腺激素内分泌抑制治疗，通过抑制促甲状腺激素降低对甲状腺的刺激，从而抑制肿瘤的复发；对于恶性程度高，复发及转移可能性大的甲状腺恶性肿瘤，还可术后行131I放射性治疗，但对于难治性碘抵抗、低分化及未分化甲状腺癌，由于摄碘能力较低，故131I放射性治疗的效果并不理想，且早期转移、周围组织侵犯及术后复发的发生风险更高。因此，基因靶向治疗的重要性显得尤为突出，这也符合目前全球提出的精准医疗的概念。

对于Ras突变型甲状腺癌而言，Ras基因的产物-RAS蛋白通过对GTP的结合持续活化，进一步诱发MAPK通路和PI3K通路一系列的级联反应。因此，针对Ras突变的分子治疗，主要包括与Ras通路有关的Raf激酶、MEK、ERK的研究以及对RAS蛋白的研究。其中索拉菲尼是一种靶向作用于血管内皮生长因子受体2、3、转染重排的RTK抑制剂,其通过作用于Raf-MEK-ERK通路后，阻断肿瘤细胞的增殖和血管生成。美国食品药品管理局早在2013年已批准索拉菲尼为晚期甲状腺癌、放射性碘抵抗甲状腺癌的进展期首选药物[46]，2017年国家食品药品监督管理总局也批准了索拉菲尼用于治疗难治性分化型甲状腺癌。一篇有关索拉菲尼对分化型甲状腺癌、髓样癌及未分化癌疗效的回顾性研究显示,其对甲状腺肿瘤的缓解率和稳定率分别为21%和60%[47]。

RTK抑制剂仑伐替尼可以抑制血管内皮生长因子受体的激酶活性，进而抑制细胞增殖和肿瘤生长，从而延缓病情的进展，为肿瘤的晚期挽救治疗提供了治疗方案。MEK抑制剂SL327与RTK抑制剂舒尼替尼在抑制甲状腺癌细胞活力、促进肿瘤细胞凋亡、减弱细胞侵袭性等方面具有显著协同作用[48]。

4 小 结

Ras基因突变是甲状腺癌发生、发展的重要原癌基因之一。主要通过MAPK通路及PI3K通路诱导肿瘤的发生及发展；也可通过抑制凋亡通路加速细胞周期，促进细胞增殖，尤其是在滤泡型甲状腺癌中，Ras基因的表达率较高，且当Ras基因与BRAF或TERT基因共突变时，甲状腺癌转移复发及侵犯周围的风险增高，这可帮助一线临床医师提供有效的风险评估和合理的治疗方案。肿瘤患者的Ras阳性仍是现今肿瘤治疗的一大难题，但靶向Raf/MEK/ERK已取得重大进展。针对Ras突变的肿瘤治疗能更有效地降低化疗药物的毒性，提高疗效，但目前其作用机制及对甲状腺癌细胞的影响仍然处于探索阶段，后期研究仍须进一步阐明肿瘤的发生机制,为肿瘤的早期诊断及分子靶向治疗提供可靠依据。