GAGE基因在恶性肿瘤中的研究进展

张静，奎翔，杨解顺，欧志燕，王燕

(昆明医科大学第二附属医院病理科，昆明 650000)

癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CTA/CT)是一类具有特异性表达模式的肿瘤相关抗原，GAGE基因家族是CTA家族的重要子成员，在正常组织中表达受限，仅在正常睾丸和肿瘤组织中表达[1]。GAGE全长650 bp，含有一个开放阅读框，编码138个氨基酸组成的蛋白质。Van den Eynde等[2]运用细胞毒性T淋巴细胞筛选法进行研究发现，GAGE序列与报道数据库中的任何基因均没有明显同源性，故将其命名为GAGE。GAGE基因家族由至少8个编码高度同源性蛋白质的基因组成，根据不同特征分为GAGE-1、GAGE-2和GAGE-8、GAGE3-7三组，其中GAGE-1最独特，其有一个在其他GAGE基因中被中断的外显子编码的C端；而其余GAGE成员(即GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-7)存在98%以上的同源性，基于GAGE-3、GAGE-7中存在一个潜在的磷酸化酪氨酸(Y9)，故分为GAGE-2、GAGE-8和GAGE-3、GAGE-7两组[3]。GAGE-1、GAGE-2和GAGE-8编码抗原肽YRPRPRRY，由人类黑色素瘤的人类白细胞抗原-CW6分子呈递，GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6和GAGE-7B编码抗原肽YYWPRPRRY，由人类白细胞抗原-A29分子呈递[4]。已有研究发现，与GAGE家族高度相关的肿瘤抗原在多种肿瘤中表达。近年研究分别针对肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌等进行探讨，检测恶性肿瘤组织中GAGE的表达，发现GAGE的表达与恶性肿瘤的生长、转移、侵袭及预后等相关[5-10]。现对GAGE基因在恶性肿瘤中的研究进展予以综述。

1 GAGE概述

GAGE是一种酸性小蛋白，含有117个氨基酸(分子量为12 900)[11]。GAGE基因家族是X染色体连锁基因，位于X染色体p21～q13[4]。既往研究认为，GAGE中存在使细胞对γ干扰素或Fas介导的细胞凋亡产生抗性的成员，可使细胞在Fas诱导的杀伤中存活下来。GAGE的抗凋亡活性位于胱天蛋白酶8激活的下游以及Fas途径中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶裂解的上游。在某些肿瘤中，细胞凋亡在抑制肿瘤发生、发展中起着至关重要的作用，因此抗凋亡基因的过度表达与肿瘤的发生有关。另有研究发现，GAGE可使细胞对化疗治疗剂、紫杉醇和γ射线产生抗性[12]。Chen等[13]研究揭示，Vault RNA可诱导癌基因GAGE家族中的GAGE-6基因，部分诱导人肿瘤细胞MCF-7耐药，Vault RNA宿主非编码小RNA的同源序列Vault RNA1-1与多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子直接结合，导致DNA结合域释放多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子靶基因(如GAGE-6)，并允许GAGE-6转录，从而诱导并促进细胞增殖和集落形成，产生耐药性。上述表观遗传调控机制可能为对抗化疗耐药提供新的治疗靶点。另有研究证实，GAGE与恶性肿瘤的转移和侵袭也有一定相关性[14]。

2 GAGE与恶性肿瘤

2.1GAGE与肝癌 2020年全球癌症数据统计显示，原发性肝癌(以下简称肝癌)是全球第六大常见癌症和第三大癌症死亡原因[15]，5年死亡率居所有肿瘤第3位，且近年40岁以下的发病率逐年升高[16]。外科手术是治疗肝癌的有效手段，但大部分患者预后较差，通常仅少于1/5的肿瘤呈局限性，可通过手术(切除和肝移植)治愈[17]。因此，寻找早期发现和评价肝癌的新的标志物有重要意义。

多种GAGE家族基因在肝细胞癌中表达。早在1999年，Schlott等[18]利用穿刺活检获得肝癌组织并提取细胞RNA，通过凝胶电泳和cDNA测序发现，60%的肝癌标本中检出GAGE-1、GAGE-2的RNA，仅在GAGE-1、GAGE-2表达缺失肝癌细胞中发现了MDM2基因的突变，提示肝癌中完整MDM2蛋白的合成与GAGE-1、GAGE-2基因表达上调有关。此外，MDM2蛋白的C端环区还参与了细胞周期素A基因的抑制，该基因控制着细胞周期蛋白从G1期向S期的转变，MDM2点突变可导致Arg转变为Ser或锌指结构的丢失。用锌指结构缺失的MDM2 RNA转染细胞时，可在转染细胞中观察到高水平的细胞周期蛋白A[19]。Riener等[20]研究发现，94%的肝癌样本呈GAGE阳性，且GAGE阳性与CD4+T细胞数量呈正相关，但与CD8+T细胞数量无关，表明GAGE蛋白表达与肝癌患者总生存率降低有关。农彩莲等[21]研究发现，GAGE-1基因在QGY-7701肝癌细胞株中呈阳性表达，而在正常肝组织中不表达，证明GAGE基因在肝癌诊断中有一定价值。Chao等[22]应用免疫组织化学技术检测到肝细胞癌组织中GAGE-1蛋白的表达，且癌组织中GAGE-1蛋白表达水平显著高于癌旁组织；且酶联免疫吸附试验结果显示，肝细胞癌、肝硬化、乙型肝炎患者以及健康人血清中均存在抗GAGE-1抗体阳性反应，表明GAGE-1蛋白具有中等的癌症限制性表达模式和免疫原性，这为GAGE-1在免疫治疗和肝细胞癌诊断中的应用奠定了基础。Shi等[23]通过多因素Cox回归分析筛选出细胞因子信号转导抑制因子2、GAS2L3、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白5、GAGE-2A等6个基因组成的预后基因特征，其中GAGE-2A是危险预后基因，在肝细胞癌预后预测方面，细胞因子信号转导抑制因子2是唯一的保护性基因标志物，而GAGE-2A等5个基因的改变与总生存期和无病生存期密切相关。但是，GAGE能否成为肝细胞癌早期诊断标志物和免疫治疗靶点还需要深入研究，以提高早期诊断指标的价值，从而更好地研制有效的靶向药物并加强免疫治疗效果。

2.2GAGE与胃癌 胃癌是全球第四大常见的癌症死亡原因，2020年癌症数据显示，约77万人因胃癌死亡[15]。目前最有效的胃癌治疗手段仍是外科手术治疗，但由于肿瘤的转移和扩散，术后患者病死率仍很高。Lee等[24]建立了实验性小鼠胃癌自发转移至多器官的模型，其卵巢种植表现出典型的Krukenberg瘤特征，并在卵巢转移的胃癌细胞中发现了35个差异表达基因，同时分析信使RNA发现，GAGE-12家族(GAGE-12J、GAGE-12B、GAGE-12I和GAGE-12G)的平均表达量超过5倍，且GAGE-12家族基因是胃癌细胞卵巢转移的最重要差异表达基因，而敲除GAGE-12基因不仅影响该基因转录，还可抑制肿瘤转移、体外肿瘤细胞球的形成和体内肿瘤的生长。由此推测，GAGE-12基因通过调控胃癌转移相关基因的表达影响胃癌的生长和转移。

Shi等[25]应用基因芯片和反转录定量聚合酶链反应技术检测有无淋巴结转移的胃癌组织中的差异表达基因，揭示了GAGE-7B在体内对胃癌转移、生长和血管生成的影响，通过免疫组织化学法检测GAGE-7B蛋白表达，基因芯片、反转录定量聚合酶链反应和Western blotting等方法检测GAGE-7B下游靶基因，结果显示，淋巴结转移灶GAGE-7B表达水平明显明显高于原发灶，且低分化胃癌细胞系中GAGE-7B的表达水平高于高分化胃癌细胞系，推测GAGE-7B高水平表达与临床分期较晚以及患者生存期较短有关。在Transwell体外实验中，GAGE-7B过表达细胞系的迁移和侵袭能力增强，提示GAGE-7B显著增强了胃癌的转移、生长和血管生成能力。

为了揭示GAGE介导胃癌发生发展的分子机制而进行的实验显示，GAGE-7B诱导的p38δ/p-促分裂原活化的蛋白激酶激活的蛋白激酶2/p-热激蛋白27受微RNA(mircoRNA，miRNA/miR)-30c负调控，抑制了GAGE-7B和p38δ的表达，从而使p38δ/p-促分裂原活化的蛋白激酶激活的蛋白激酶2/p-热激蛋白27通路被miR-30c灭活，推测GAGE-7B信使RNA是p38δ的竞争性内源性RNA，含有miR-30c结合位点的GAGE-7B-3′非编码区可诱导胃癌细胞表达p38δ，并上调p38δ/p-促分裂原活化的蛋白激酶激活的蛋白激酶2/p-热激蛋白27通路，显著促进胃癌的转移、增殖和血管形成[25]。在关于胃肠道间质瘤的研究中，Ghadban等[26]采用免疫组织化学方法对51例胃肠道间质瘤中的CT10/黑色素瘤抗原(melanoma antigen，MAGE)-C2和GAGE进行分析，结果显示，与侵袭性较低的肿瘤相比，高级别胃肠道间质瘤表达GAGE和CT10/MAGE-C2的概率更高，且表达GAGE或CT10/MAGE-C2的患者均存在中高度复发风险，通过比较临床病理参数发现，GAGE的表达与核分裂象和肿瘤大小有关，但与肿瘤的位置无关。综上所述，GAGE基因的表达与胃肿瘤的转移、恶变有重要关系。

2.3GAGE与乳腺癌 乳腺癌居全球癌症死亡率的第5位，2020年乳腺癌发病率居全球第1位，全球女性新发乳腺癌约226万例，远超女性其他癌症，全球女性乳腺癌死亡人数居癌症致死的第1位[15]。随着生活方式的现代化、生育模式的改变、社会经济水平的提高，乳腺癌发病率逐年明显升高。乳腺癌预后和治疗受到肿瘤大小、分级以及孕酮受体表达水平等临床病理因素的影响，寻找有预测价值的分子诊断标志物和有针对性的治疗方法是提高乳腺癌的早期诊断和生存率的重要方法。Vodolazhsky等[27]检测女性乳腺癌组织(不区分有无转移)GAGE-1、GAGE-3、GAGE-4的相对表达量，结果显示，乳腺癌组织GAGE-3基因的转录活性明显升高，且无区域转移的乳腺癌组织中GAGE-3表达是正常乳腺组织的5倍。Voels等[28]在研究金属硫蛋白(metallothionein，MT)3独特的C端和N端序列对MCF-7细胞表型特性和基因表达谱的影响时发现，MT3基因在大多数乳腺导管癌中过表达，且稳定转染MT3基因的MCF-7细胞出现生长抑制，在没有N端序列的情况下，MT3的C端序列诱导了MCF-7细胞的圆顶形成，体现了细胞的抗肿瘤能力；配对结果表明，GAGE基因家族的表达与MCF-7细胞形成圆顶的能力有很强的相关性，同时C端结构域可诱导GAGE基因的表达，而N端结构域抑制了GAGE基因的表达，且N端结构域的抑制作用强于MT3的C端结构域，MT3和MT对GAGE基因表达的不同影响提示其在乳腺癌的发生发展中有独特作用。采用免疫组织化学方法对454例浸润性导管癌(包括225例雌激素受体/孕激素受体/人类表皮生长因子受体2阴性乳腺癌)中8种CT抗原(MAGEA、CT7、NY-ESO-1、CT10、CT45、GAGE、SAGE1和Nxf2)表达进行检测的研究显示，雌激素受体阴性乳腺癌中上述8种CT抗原的表达率均显著高于雌激素受体阳性乳腺癌[29]。在乳腺癌中，GAGE等CTA的表达水平显著上调，提示其参与了细胞增殖和细胞凋亡，且增殖细胞核抗原的升高可促进细胞增殖[8]。综上，GAGE有望在乳腺癌早期联合诊断和靶向治疗中发挥重要作用。

2.4GAGE与黑色素瘤 黑色素瘤是起源于黑色素细胞的恶性肿瘤，可发生于任何有黑色素细胞的器官，皮肤是黑色素瘤最常见的发生部位。2018年全球新发黑色素瘤病例近29万，约6.1万例黑色素瘤患者死亡[30]。黑色素瘤侵袭性强，早期易发生淋巴结及血行转移，临床预后差，常规治疗(外科手术治疗和化疗等)效果并不理想。近年发现，黑色素瘤对多种免疫治疗方法有反应，且免疫疗法有了很大的突破，黑色素瘤细胞表达的抗原可以被免疫系统识别，进而诱导对瘤细胞的免疫反应。Bazhin等[31]通过制备针对GAGE家族蛋白的多克隆、单克隆抗体，研究GAGE家族蛋白在黑色素瘤细胞系和肿瘤标本中的表达，对17个黑色素瘤细胞系进行Western blotting分析，结果显示，其中10个细胞系中存在GAGE蛋白，而正常黑色素细胞和角质形成细胞系HaCat中无GAGE家族蛋白的表达。单独使用去甲基化药物以及去甲基化药物和组蛋白脱乙酰酶抑制剂联合使用均可刺激GAGE家族蛋白的表达。Danilova等[32]比较22个黑色素瘤和27个软组织骨肉瘤细胞系中主要CTA家族基因的表达，结果显示，95.9%(47/49)的细胞系显示CTA基因活性，包括GAGE、NY-ESO1、MAGEA1、PRAME基因表达的发生率有显著差异，黑色素瘤细胞系中GAGE、NY-ESO1、MAGEA1、PASD1、PRAME的表达水平显著高于软组织骨肉瘤细胞系，且黑色素瘤细胞中存在GAGE、SLLP1的基因共表达，骨肉瘤细胞中存在GAGE和NY-ESO1的基因共表达，提示GAGE基因共表达可能与其在肿瘤侵袭和转移过程中的作用有关，在前瞻性临床试验中，CTA的表达模式应作为反应生物标志物进行评估。综上，黑色素瘤中GAGE存在差异性表达，其成为免疫疗法靶标的可能性较大，但相同类型肿瘤患者的CTA表达水平可能存在很大差异，故还需进一步研究。

2.5GAGE与肺癌 目前，肺癌仍是全球癌症死亡的主要原因，2020年肺癌致死人数仍较多，约占所有癌症死亡人数的18%[15]。过去40年中，大多数国家的男性肺癌发病率下降，但女性肺癌发病率却持续上升[30]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌的85%，肺腺癌是最常见的NSCLC组织学类型，约占所有肺癌相关死亡的40%[33]。对肺癌中CTA表达的研究主要集中在XAGE、MAGE、GAGE、NY-ESO1等家族，其表达率为10%～60%[34]。Ko等[35]研究CD133和癌症抗原(GAGE、MAGE-6、SSX等)在NSCLC细胞系中的表达，经过去甲基化试剂处理后，CD133表达消失，但处理前后均未检测到GAGE(1，2，8，b3-7)的表达，说明GAGE的表达与CD133的表达无关，提示GAGE表达的机制可能并不是去甲基化。Zhang等[36]利用环状RNA(circular RNA,circRNA)芯片筛选circRNA表达谱的差异发现，与邻近正常组织相比，NSCLC样本中circ_0016760表达水平最高。Li等[37]采用定量反转录聚合酶链反应进行研究发现，circ_0016760在NSCLC组织和细胞中表达上调，而miR-1287负向调节GAGE-1的表达，circ_0016760作为miR-1287的竞争性内源性RNA促进靶基因GAGE-1的表达，通过海绵化miR-1287上调GAGE-1表达，从而促进NSCLC细胞的增殖和侵袭。Gjerstorff等[38]采用免疫组织化学方法检测NSCLC组织和正常肺组织中GAGE、NY-ESO1、SP17的表达，结果显示，GAGE、NY-ESO1和SP17的表达与特定组织类型(腺癌和鳞状细胞癌)无明显相关性，但鳞状细胞癌中GAGE、NY-ESO1和SP17高水平表达的占比更高，GAGE在Ⅱ～Ⅲa期NSCLC中的表达频率显著高于Ⅰ期，但未发现GAGE与生存终点的相关性，NSCLC中GAGE的表达频率与MAGE-A3相似，目前MAGE-A3已作为疫苗靶点在NSCLC中进行测试，提示GAGE有潜力成为NSCLC免疫治疗的候选靶点和多抗原联合的疫苗，在肿瘤的免疫靶向治疗中有巨大潜力。Du等[39]针对p53、PGP9.5、SOX2、GAGE-7、GBU4-5、MAGEA1和CAGE 7种肿瘤相关抗原检测肿瘤相关自身抗体水平，结果显示，肿瘤相关自身抗体能区分良恶性肺部病变和无肺部结节肺疾病，灵敏度为56.53%，特异度为91.60%，且其结合CT检查诊断的特异度可提高至95.80%，表明肿瘤相关自身抗体可用于基于血清的肺癌诊断工具的开发，特别是与CT联合应用，可为肺癌的筛查和早期诊断提供更具临床价值的检测方法。

2.6GAGE与其他恶性肿瘤 除上述肿瘤外，目前对GAGE在其他恶性肿瘤(如食管癌、宫颈癌、喉癌、甲状腺癌)中的表达和作用也有研究。Götte等[40]评估了晚期糖基化终末产物受体和GAGE家族抗原作为头颈部肿瘤免疫治疗靶标的可能性，GAGE在来源于喉和咽的10个正常黏膜标本中的表达均为阴性，但其在肿瘤样本中的表达均为阳性。Figueiredo等[41]发现，喉鳞状细胞癌中CTA的表达率很高，且与临床分期有关，包括GAGE在内的CTA可能是有价值的喉肿瘤疫苗靶标，特别是对于预后较差的肿瘤。Chang等[42]的研究发现，GAGE基因可能参与宫颈上皮内瘤变向宫颈癌的发生发展，故可能是子宫颈癌的治疗靶点。Melo等[43]利用免疫组织化学方法检测了包括GAGE家族的CTA在正常甲状腺、甲状腺肿、甲状腺癌中的表达，发现CTA在正常甲状腺和甲状腺肿中不表达，而乳头状癌和滤泡状癌中GAGE的阳性表达率为10.8%，髓样癌中GAGE阳性表达率为92.9%，低分化癌和未分化癌中GAGE阳性表达率为66.7%，且GAGE的表达与性别显著相关，可见GAGE等抗原在甲状腺癌中明显表达，表明该抗原具有作为甲状腺癌生物标志物的潜力。Iura等[44]采用免疫组织化学实验检测GAGE-7在子宫平滑肌肉瘤和非子宫平滑肌肉瘤中蛋白表达情况并比较其表达谱，发现GAGE-7在子宫平滑肌肉瘤中的阳性表达率明显高于非子宫平滑肌肉瘤，推测GAGE-7可能是潜在的子宫平滑肌肉瘤免疫治疗靶点。

3 小 结

GAGE基因在恶性肿瘤发生、发展过程中的作用不容忽视，与恶性肿瘤增殖、浸润、转移的关系密不可分，有望成为肿瘤早期诊断和预后评估的分子标志物，也是临床靶向治疗的重要方向。进一步研究GAGE基因抗肿瘤药物的机制对提高个体化免疫靶向治疗的有效性有重要意义。目前，不同组织来源的肿瘤中GAGE子成员的表达和程度有所差异，而其在恶性肿瘤中的高表达趋势是一致的，但具体作用机制和分子通路还需深入研究。随着未来更多临床研究和试验的进展，GAGE基因有望在临床诊断和治疗中发挥更大的作用。