Pif1维持基因组稳定性在肿瘤中发挥的作用

陈波，李志杰

（中国医科大学附属盛京医院医学研究中心，辽宁省环境与代谢疾病动物模型研究与应用重点实验室，沈阳 110004）

解旋酶是生物体内核酸代谢中必不可少的酶，能将遗传物质传递给后代［1］。解旋酶被称为分子运动蛋白，沿着DNA磷酸二酯主链单向转移，利用核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTP）水解的能量将稳定的DNA双链分离成单链或改造核酸蛋白复合物［2］。解旋酶参与多种细胞功能的调控，与肝癌、乳腺癌和卵巢癌等肿瘤的发生发展密切相关［3-5］。

基于解旋酶序列的保守性，可分为6个不同的超家族（superfamily 1-6，Sf1-Sf6）。根据在核酸中移位的方向性，这些家族又被分为A（典型代表为PcrA和Srs2）和B（典型代表为RecD2和Pif1）2组［6］。Pif1属于超家族ⅠB解旋酶，在核酸上沿5’-3’方向转位［6］。文献［7］报道，Pif1可抑制DNA损伤，防止G4四链体的复制停顿和双链断裂（double strand breaks，DSBs），并通过调节端粒酶在DSBs上的作用抑制总染色体重排（gross chromosomal rearrangement，GCR），提示Pif1在维持基因组稳定性方面具有不可或缺的作用。本文对Pif1在DSBs修复相关DNA复制中发挥的作用进行综述，利于对Pif1在维持基因组完整性上所发挥作用的理解。

1 Pif1与基因组稳定性

Pif1在不同生物体中有单个或多个亚族。目前，已知酿酒酵母基因组编码2个Pif1同源基因（Pif1和Rrm3），裂殖酵母、小鼠和人类基因组只编码1个Pif1同源基因（分别为Pfh1，mPif1和hPif1）［8］。作为DNA解旋酶家族中的典型成员，Pif1在线粒体基因组维护中发挥多种作用，包括线粒体基因组维持、端粒形成的抑制和冈崎片段处理等［2-9］。

1.1 线粒体基因组的维持

在正常细胞中，线粒体是主要细胞器，对内环境的调控至关重要。由线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变引起的功能障碍，与肿瘤的发生发展密切相关［10］。酿酒酵母Pif1最初在基因筛检中分离出，其突变会影响线粒体基因组的重组频率［11］。Rrm3基因编码另外5’-3’方向的DNA解旋酶，最初是因其在核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA）中引起重组升高而被识别，后经蛋白质组分析也发现其位于线粒体［12］。尽管Pif1和Rrm3在结构上相似，并通过作用于共同的靶点来促进基因组的完整性，但它们在线粒体中具有不重叠和甚至有时相反的作用［2-13］。

在Pif1缺乏的细胞中，mtDNA的重组减少，这提示Pif1对mtDNA复制和重组至关重要［14］。在Pif1突变体中，细胞对溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）诱导的DNA损伤敏感，mtDNA易碎裂并随之丢失［15］。此外，在Pif1缺乏的细胞中，在特定位点发生mtDNA的断裂，这意味着Pif1可以阻止或修复mtDNA中的DSBs［15］。研究［16］表明，下调Pif1基因可降低结肠癌细胞存活率，但对正常细胞没有影响，这可能是由于其在重新启动停滞的复制叉方面的作用。

1.2 端粒形成的抑制

Pif1作为从头端粒形成和延伸的负调控因子，以检测失去亚端粒基因表达的突变体。在Pif1缺失的情况下，端粒长度增加约75个碱基对［17］。Pif1蛋白的过量产生可恢复mtDNA重组能力，并适度缩短端粒长度［18］。Pif1的过表达导致CDC13-1和Ku缺陷菌株的活力降低，且该表型被EXO1的突变抑制，该突变编码端粒降解外切核酸酶，表明Pif1去除端粒酶会降低端粒末端保护功能［19］。

在酿酒酵母中，DNA损伤会导致Pif1的磷酸化，从而阻断DSBs端粒酶的活性，但不会阻断染色体末端的活性［20］。Pif1和Rrm3由不同的框架翻译起始密码子表达，与Pif1突变体表现出的端粒酶活性依赖的高GCR率不同，Rrm3基因突变既不影响GCR率，也不影响从头端粒的添加［21］。然而，Rrm3在体内仍然与端粒相关，并在端粒DNA的及时复制中发挥重要作用，影响端粒的长度［21］。hPif1的氨基酸序列与酿酒酵母Pif1和Rrm3具有同源性［22］，在体内外，与端粒酶的催化亚基hTERT相互作用，并在过表达时缩短端粒长度，这表明其在功能上与酿酒酵母Pif1具有相似性。

1.3 冈崎片段的成熟

基于双链体DNA的反向平行结构，当前导链不断向复制叉延伸时，后随链DNA复制是一系列连续的过程，这些过程连接形成冈崎片段［23］。在酿酒酵母中，DNA聚合酶δ（DNA polymerase δ，Polδ）在每个细胞周期内产生约十万个冈崎片段，且每个片段都需要以高保真度连接到DNA链中，以避免未修复缺口的积累导致DSBs和细胞致死性［24］。

通过对裂殖酵母的研究，发现Pif1在冈崎片段的加工中起重要作用。其中，对温度敏感的Cdc24等位基因被Pfh1+（酿酒酵母的同系物）内的突变体抑制，而Pif1和Dna2-C2突变体对温度敏感的生长缺陷被Pfh1-R20（Pfh1的冷敏感突变体等位基因）抑制［25］。在酿酒酵母中观察到了类似的作用，Pif1突变体在30 ℃时抑制了Dna2突变体的致死表型，但在更高的温度下却没有［26］。即使在37 ℃时，Pif1-Dna2双重突变体仍然存在，但DNA聚合酶32（DNA polymerase 32，Pol32）会额外缺失，而Pol32缺失编码Polδ的非必需亚基，提示Pif1和Pol32通过持续性刺激有助于下游冈崎片段的置换和更长的链瓣产生Polδ［6］。综上，在后随链合成过程中，Pif1和Pol32产生了需要Dna2活性才能完成DNA复制的中间底物，有利于冈崎片段的形成。

1.4 DNA合成的修复

在裂殖酵母中，Pfh1不仅需要完成DNA复制，还需要对DNA破坏剂作出反应。对冷敏感的Pfh1-R20突变细胞在特定温度下对甲磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）和羟基脲（hydroxyurea，HU）高度敏感，表明其在DNA损伤修复中的作用［27］。在酿酒酵母中，与裂殖酵母Pfh1突变体相比，Pif1突变体对MMS和HU仅有中等敏感性。然而，Pif1在γ射线照射后与Rad52（同源重组蛋白）共定位在核内，从而修复了病灶，表明Pif1对DSB的修复和重组具有特异性作用［28］。据文献［29］报道，Pif1在通过断裂诱导复制（break-induced replication，BIR）途径产生DSB修复产物中具有重要作用。

2 Pif1与肿瘤的调控

基因组不稳定性突变被认为是癌症发生和发展的重要诱因，而线粒体基因组维持、端粒形成的抑制和冈崎片段处理等对维持基因组的稳定性至关重要。解旋酶被证明在保护细胞免受DNA损伤中起关键作用。与Pif1在维持复制叉完整性中的作用相一致，肿瘤细胞中Pif1的消耗可以防止从胸苷诱导的复制停滞释放后进入S期并减慢S期进程［30］。研究［16］指出，Pif1具有在S期进入和在新的复制位点上触发起点的作用，为维持基因组稳定性所必需。当新的复制位点对起始点激发的需求增加时，尤其是在致癌基因诱导的复制应激期间，这可能变得至关重要。据文献［31］报道，致癌基因的活化和进入S期的失控可能导致肿瘤细胞出现慢性DNA复制应激。在这种情况下，肿瘤细胞表现出对Pif1的依赖性增加，以维持生存能力。研究［32］表明，细胞中Pfh1-L430P等位基因的表达导致细胞核和线粒体功能的丧失，而该变异体无法补充Pfh1在细胞核和线粒体中的基本功能，从而增加了乳腺癌的患病风险。

Pif1可以负调控端粒酶，促进冈崎片段的处理。当细胞内Pif1缺乏或失调时，冈崎片段的成熟受到抑制，加大了正常细胞向肿瘤转变的可能性。据文献［33］报道，Pif1能够抑制DNA末端的端粒酶活性，端粒长度稳态对维持基因组稳定至关重要，端粒酶的激活和抑制是治疗人类疾病的潜在疗法。Pif1被证明在DSB修复中起关键作用，其中，BIR是主要的修复途径，而Pif1可以通过控制核酸酶活性在端粒上启动DDR［34］。此外，必需的端粒“帽”蛋白通过抑制DNA损伤反应和调节端粒酶募集，将端粒与DSB区别开来，从而发挥抗癌的作用［35］。

3 总结

Pif1是一类高保守的解旋酶，涉及各类核酸的处理。尽管Pif1在酵母细胞中具有作为全能DNA代谢参与者的多功能性，但与裂殖酵母或更高等的真核生物中其直系同源物的作用不一致。mPif1缺失突变几乎没有可见的表型，包括端粒长度未出现改变。虽然hPif1的功能有很多未知，但保守的Pif1残基的突变与乳腺癌易感性增加有关，这表明hPif1可能起到抑癌作用。即使酿酒酵母Pif1和Rrm3，以及hPif1表达定位于裂殖酵母的线粒体和细胞核中，这些同源物都不能提供Pif1的所有基本功能。

Pif1解旋酶家族的每个成员都具有自己独特的活性，这是由于其结构、寡聚状态和底物选择等方面的决定性差异。鉴于Pif1解旋酶家族在细胞中广泛的独特功能，随着对Pif1解旋酶家族进行更全面而深入的研究，将揭示Pif1在人类相关肿瘤疾病中所发挥作用的更多细节，也为抗癌新药的设计等提供新的靶点和思路。