DNA甲基转移酶与心脏纤维化的研究进展

谢青文 唐其柱

心脏纤维化是各种心血管疾病不可避免的病理改变之一，主要是由于细胞外基质过度沉积，致使心脏收缩和舒张功能障碍，最终导致心律失常和心力衰竭。心脏纤维化的主要效应细胞成纤维细胞可被各种病理刺激激活，从而进行增殖，分化为肌成纤维细胞，并产生各种细胞因子和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白。目前还没有治疗心脏纤维化的方法，因此了解心脏纤维化的病理发生机制具有重要意义。DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，通常发生在对环境刺激的反应中，在调控基因表达中起关键作用。最近研究表明，DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在心脏纤维化中起着重要作用，控制DNA甲基化可能成为抗纤维化治疗的新策略。本文就DNA甲基转移酶在心脏纤维化中的作用最新研究进展进行综述，寻找心脏纤维化治疗新靶点。

一、DNMTs概述

DNA 甲基化是指DNA的特定碱基在DNMTs的作用下，共价结合一个甲基基团的化学修饰过程，可以发生在多个碱基基团上。在一般研究中，主要是指在胞嘧啶第5位碳原子上添加一个甲基，产生 5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程，通过基因启动子区域的DNA甲基化参与转录基因沉默。在真核生物中，DNA甲基化主要发生在CpG岛，主要DNMTs和甲基结合蛋白调控。目前，哺乳动物中共发现了五种DNMT 蛋白，但只有 DNMT1、DNMT3A 和 DNMT3B 具有甲基转移酶活性[1]。在DNA复制过程中，DNMT1将DNA甲基化从母链复制到新合成的子链。DNMT3A和DNMT3B参与从头甲基化，在缺乏模板的情况下建立新的DNA甲基化模式。已有研究表明，在人类和小鼠心脏中表达的主要DNA甲基转移酶是DNMT3B，而其他甲基转移酶，DNMT1和DNMT3A几乎检测不到，而且DNMT3B敲除的心脏中存在着广泛的间质纤维化[2]。另外有研究发现，在异丙肾上腺素诱导的大鼠心脏纤维化模型中，心脏成纤维细胞DNMT3A表达上调，miR-29a及其miR-26a-5p通过下调DNMT3A而降低成纤维细胞的增殖和活化，从而改善心脏纤维化[3,4]。这些结果说明，DNMTs各亚型在心脏纤维化中的作用不同，还需更多研究去探索DNMTs参与心脏纤维化的作用机制。无论是心肌梗死引起的急性缺血性损伤，慢性高血压引起的压力超载，还是糖尿病引起的代谢功能障碍，均能使心脏细胞DNA甲基化机制功能失调，导致心脏纤维化。下面笔者将讨论DNMTs在缺血性心肌病、压力负荷诱导的心肌病以及糖尿病性心肌病等心脏纤维化病理机制中的作用。

二、DNMTs与心脏纤维化发生的关系

1.缺血性心肌病：DNA甲基化在缺血性心肌病中发挥重要作用。实验证实转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可抑制DNMT1蛋白的表达和活性，从而抑制α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)启动子甲基化，导致心肌梗死区α-SMA表达大幅增加。但是在该研究中， DNMT3A和DNMT3B表达水平差异无统计学意义[5]。Jeong等[6]研究发现在心肌梗死中，DNMTs抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5AZA)可显著改善心脏功能和纤维化，这与巨噬细胞中干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1，IRF1)的SUMO化有关。内皮细胞通过内皮-间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)获得纤维增殖表型，在新生内膜病变的形成中发挥关键作用。缺氧可通过低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1 α，HIF1α)和TGF/SMAD信号通路通过DNMT3A介导的Ras-Gap样蛋白1(Ras-Gap-like protein 1，RASAL1)启动子的高甲基化，诱导人冠状动脉内皮细胞EndMT[7]。

人冠状动脉内皮细胞暴露于高磷酸盐环境时也发生EndMT。进一步研究证明，这种EndMT是通过组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2，HDAC2)将异常磷酸化的DNMT1募集到RASAL1 CpG岛启动子上，并激活常见的EndMT调控因子Twist和Snail而导致的[8]。缺氧产生的自由基也可能激活Snail，上调DNMT1和DNMT3B，使RASSF1A蛋白合成显著减少，相关纤维化标志物增加。细胞外超氧化物歧化酶可以通过Ras/ERK途径显著降低DNMT1和DNMT-3B介导的RASSF1A基因甲基化，从而缓解缺氧诱导的心脏纤维化[9]。在研究血管成形术诱导再狭窄机制时，发现猪冠状动脉DNMT1和DNMT3A对细胞因子信号的抑制基因(suppression of cytokine signaling 3，SOCS3)具有抑制作用，抑制DNMT1和DNMT3A对防止冠状动脉再狭窄可能具有重要临床意义[10]。同时，该研究还发现抑制血管平滑肌细胞DNMT1可诱导DNMT3A表达。DNMT1和DNMT3A之间存在一种相互调节的机制，在DNMT1缺失的情况下，诱导DNMT3A可补偿DNMT1功能的丧失。这些研究结果表明，在缺血性心肌病中，DNMTs通过沉默基因表达发挥促纤维化或抗纤维化作用，但是DNMTs抑制剂治疗心脏纤维化却表现出积极作用。

2.压力负荷诱导的心肌病：在压力负荷诱导的心肌病中，心脏纤维化是心肌重构的一个重要病理改变。微小RNA与DNA甲基化的相互作用可能是心脏纤维化疾病遗传因素缺失的原因。腹主动脉缩窄术后的大鼠纤维化心脏及雷帕霉素诱导的心脏成纤维细胞自噬中，DNMT3A表达水平均上调。DNMT3A通过调控miR-200b参与心脏成纤维细胞自噬[11]。同样地，Tao等[12]研究发现，腹主动脉缩窄大鼠心脏DNMT3A及纤维化相关蛋白α-SMA和胶原蛋白Ⅰ表达显著升高。心脏成纤维细胞转染DNMT3A-siRNA对TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖有明显抑制作用。miR-369-5p介导的Patched1的DNMT3A表观遗传沉默是心肌纤维化中成纤维细胞增殖的机制。容量负荷诱导的心衰小鼠心脏中的DNMT1水平上调，TIMP4表达下调，相应的，MMP9的表达也上调，使ECM蛋白产生与降解失衡[13]。低剂量5-AZA可以减轻压力负荷小鼠心脏纤维化，血管周围胶原蛋白含量显著降低，这种胶原沉积的减少反映在心脏胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ mRNA水平的减少，虽然射血分数无差异，但是心脏舒张功能得到明显改善[14]。

虽然5-AZA已获监管部门批准用于血液系统恶性肿瘤的治疗，但其在临床肿瘤中的治疗与多种副作用有关。这些不良反应包括胃肠道不适、体重减轻和骨髓抑制等。另有一项研究发现5-AZA 治疗的4例肿瘤病例(既往有心血管疾病史)出现射血分数改变和心衰症状，但是该研究并未确定所报道的心脏不良事件是由5-AZA治疗引起的还是与本身的疾病过程有关[15]。因为低剂量5-AZA比骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病患者的临床给药剂量低5倍，5-AZA对体重无影响，耐受性良好[14]。自发性高血压大鼠经5-AZA治疗后，血管周围胶原蛋白水平也显著降低，5-AZA处理的人心室心脏成纤维细胞胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和α-SMA表达减少[16]。此外，DNMT抑制剂RG108可以通过下调肌浆内质网Ca2+-ATP酶2α(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2α，SERCA2α)和β2-肾上腺素受体，减轻主动脉弓缩窄诱导的大鼠心肌纤维化[17]。CRISPR/Cas9介导的DNMT3A缺失小鼠在血管紧张素Ⅱ刺激后心功能进一步下降，心肾纤维化程度更严重[18]。在肺动脉高压中，右心室成纤维细胞DNMT1表达上调，DNMT3A和DNMT3B无变化。右心室成纤维细胞通过DNMT1-HIF1α-丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)促进胶原合成和右心室纤维化。这种表观遗传线粒体代谢途径也是一个潜在的抗纤维化治疗靶点[19]。总之，上述研究结论并不一致，即使在压力负荷诱导的心脏纤维化中，DNMTs各亚型的作用仍具有不确定性，而针对DNMTs的各种治疗方法也成为潜在的候选者。

3.糖尿病性心肌病：糖尿病是心血管疾病一个危险因素，糖尿病心肌病后期也存在严重的心脏纤维化。在一项糖尿病随访研究中，无论是糖尿病还是非糖尿病，心血管疾病的发生均与DNA甲基化有关，但两者DNA甲基化修饰存在差异[20]。研究发现糖尿病心肌纤维化组织中DNMT1表达增加，然而DNMT3A和DNMT3B保持不变[21]。Tao等[22]研究也发现DNMT1在高糖诱导的心脏成纤维细胞中的表达增加，而且DNMT1介导的SOCS3启动子高甲基化，导致SOCS3在糖尿病心肌纤维化中的表达下调，进而促进信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)活化，促进心脏成纤维细胞活化和胶原沉积。基因或药理学失活的DNMT1逆转心脏成纤维细胞的激活表型。

在糖尿病心肌病患者心脏中，同样观察到DNMT1与SOCS3表达水平负相关，DNMT1表达增加和SOCS3表达缺失。血清同型半胱氨酸浓度升高是糖尿病性心脏纤维化的危险因素，雄激素受体的DNMT1甲基化触发了同型半胱氨酸诱导的心脏成纤维细胞自噬损伤。然而，也有研究显示，在链脲佐菌素诱导的糖尿病中，尽管心脏各细胞基因表达发生了显著变化，但DNA甲基化仍保持稳定[23]。心脏外的甲基化也有可能参与糖尿病心肌病的发生、发展过程，超氧化物歧化酶模拟物B12通过调节肝脏DNMTs及SOCS 1/3来激活肝脏胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)的产生以及抑制氧化应激，减少心脏纤维化面积，增强心脏保护作用[24]。以上研究说明，在糖尿病心肌病中，除了心脏的DNMTs直接参与心脏纤维化，其他器官的DNA甲基化也可能对心脏纤维化产生影响。

4.其他心血管疾病：在脂多糖刺激下，心脏成纤维细胞焦亡相关蛋白Caspase 1和NLRP3以及DNMT1表达增加，lncRNA GAS5的DNMT1甲基化通过NLRP3导致心脏成纤维细胞焦亡[25]。阿霉素诱导的心脏损伤中，DNMT1的表达上调，使用CRISPR/cas9技术特异性敲除心脏DNMT1可改善心脏纤维化。DNA甲基化是生物衰老的强大决定因素，随着年龄的增长，成年大鼠心脏中DNMT1表达明显下调[26]。但有研究显示,随着年龄增长小鼠心脏成纤维细胞的甲基化状态在14周龄之后没有明显变化，心脏成纤维细胞在增殖、胶原表达或DNA甲基化方面没有表现出年龄依赖性的增加[27]。这说明年龄相关的心脏纤维化增加，不能直接归因于成纤维细胞增殖的改变或ECM基因表达的增加。DNMTs参与各种心血管疾病的心脏纤维化，这为心脏纤维化的机制研究提供了更多见解。

三、DNMTs作为标志物及治疗靶点的研究进展

DNMTs是心脏纤维化研究和治疗中的一个新领域。DNA甲基化可用作疾病的生物学标志物。在一项全表观基因组关联研究中，729例心脑血管病患者血液样本中存在特异性DNA甲基化改变。在急性心肌梗死患者的211个CpG位点上发现了不同的DNA甲基化，其中42例与心血管功能、心肌发育和缺血性损伤反应相关的基因有关[28]。尽管DNMTs抑制剂已获批准用于不同器官的纤维化疾病，但将这些药物用于治疗心脏纤维化仍存在重大挑战。5-AZA处理的小鼠DNMT1和DNMT3B基因表达显著下调，而DNMT3A水平差异无统计学意义，但是5-AZA导致DNMT1和DNMT3B表达降低的机制尚不明确[14]。

肼苯哒嗪对心脏也具有保护作用，部分与抑制DNMT1活性有关，DNMT1活性可降低SERCA2a启动子的甲基化程度，调节心肌细胞的钙稳态。此外，肼苯哒嗪还能诱导TET3，促进RASAL1启动子去甲基化[29]。因此，肼苯哒嗪可同时靶向DNMT和TET3，有潜力成为治疗心肌纤维化的一种新的非核苷酸表观遗传药物。CRISPR/Cas9是重要的基因编辑工具，在抗纤维化研究中，CRISPR/Cas9可用于恢复TET3的表达，以RASAL1和Klotho甲基化的启动子为靶点减少纤维化[30]。总之，DNMTs不仅可作为心脏纤维化的生物学标志物，其抑制剂还可通过调控纤维化相关基因的甲基化发挥心脏保护作用。

四、展 望

综上所述，DNMTs在心脏纤维化过程中参与了成纤维细胞的增殖和分化，以及ECM蛋白的产生和降解，为心脏纤维化的诊断和治疗提供了新的策略。临床研究已发现DNA甲基化与心血管疾病具有相关性，提示DNMTs可能作为心脏纤维化的诊断和预后指标。心脏纤维化目前尚无有效的治疗方法，DNMTs各亚型在心脏纤维化中发挥不同的作用，相关具体机制仍需进一步探索。虽然DNMTs同时具有促纤维化和抗纤维化作用，但是DNMTs抑制剂对心脏纤维化始终产生有益作用，其作用机制仍不明确，也许开发针对DNMTs亚型的特异性抑制剂是另一治疗心脏纤维化的有效方法。总而言之，以DNA甲基化过程尤其是DNMTs作为靶点在心脏纤维化及心血管疾病中具有巨大的潜力，相关领域的研究也越来越多，经过不断地探索研究，相信能够在理解心血管疾病发生机制及其治疗方法中，发挥重要作用。