细胞焦亡在心血管疾病中的作用及治疗意义

黄明辉，张 景，汤玲玲，胡 钰

目前，心血管疾病是人类首要致死原因之一，但其发病机制仍未完全明确。心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和心肌成纤维细胞死亡和新生的平衡维持着心血管系统的结构及功能。细胞死亡和非感染性炎症反应在心血管疾病的发生发展过程中发挥着重要作用[1]。基于形态特征变化，细胞死亡主要包括凋亡、自噬性细胞死亡和坏死。凋亡是一种程序性细胞死亡，细胞出现DNA断裂、染色体聚集、细胞收缩、胞膜空泡化、形成凋亡小体但质膜仍保持完整，此外未发生炎症反应，自噬性细胞死亡与自噬过程密切相关，自噬发生时，胞质内容物被自噬体吞噬降解，而在病理条件下，自噬失调，发生率增加10倍以上导致细胞死亡；坏死是一种受调控的细胞死亡方式，细胞和细胞器发生肿胀，最终细胞膜破裂，染色质轻度浓缩但细胞核保持完整[1]。

焦亡是一种促炎性的程序性细胞坏死，细胞形态变化结合了凋亡和坏死的特征，细胞质膜上形成膜孔，细胞肿胀迅速破裂，释放前炎性因子和细胞内容物[2]。研究发现，焦亡及其相关的炎性因子在血管炎症反应和心血管疾病进程中发挥着重要作用[2]。本研究将焦亡相关分子通路及其在心血管疾病中的作用研究进展进行综述。

1 焦亡及其通路

焦亡由微生物感染或损伤等细胞内外相关信号诱导半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1、Caspase-11、Caspase-4、Caspase-5，进而释放促炎因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)]，使细胞膜完整性被破坏。焦亡主要包括依赖Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4/5(人)及Caspase-11(小鼠)的非经典途径[3]。在经典途径中包括NOD样受体(NOD like receptor proteins，NLRPs)NLRP3、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)和热蛋白(pyrin)等炎性小体。炎性小体通过病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)、危险信号分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)活化后募集凋亡相关斑点样蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a Caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]和pro-Caspase-1。CARD与pro-Caspase-1相互作用启动自我剪切形成活化的Caspase-1；此外活化的Caspase-1将IL-1β和IL-18前体分子转化为成熟的炎症分子。活化的Caspase-1剪切GSDMD(gasdermin 蛋白家族成员)和31 kD GSDMD-N寡聚体释放出GSDMD-N，释放出的GSDMD-N在胞膜上形成孔洞，进而促进炎性因子的释放和细胞肿胀，引发焦亡。在非经典途径中，小鼠细胞的Caspase-11或人细胞的Caspase-4/5识别脂多糖(LPS)后直接剪切GSDMD启动焦亡；同时，GSDMD-N激活NLRP3炎性小体，Caspase-1活化IL-1β和IL-18。

此外，GSDME可以将肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或化疗药物引起的Caspase-3介导的凋亡转化为焦亡。Caspase-3剪切GSDME产生GSDME-N引起膜穿孔诱导焦亡[4]。在硬骨鱼中仅存在GSDME，其被Caspase-1、3、7剪切后诱导焦亡[5]。耶尔森菌属中的细菌毒力因子YopJ抑制Tak1激酶后诱导了Caspase-8依赖的GSDMD剪切而引起细胞焦亡[6]。此外，激活Caspase-8触发了NLPR3炎症小体，Caspase-8和Caspase-11放大了炎症反应[7-8]。所以，Caspase-3/GSDME和Caspase-8/GSDMD通路可能也是焦亡相关通路。

2 焦亡执行者：gasdermin蛋白家族(GSDMs)

GSDM是细胞焦亡的主要执行者。在人类中存在6种GSDMs成员：GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB59，在小鼠中没有GSDMB，存在3种GSDMA同源蛋白(GSDMA1-3)和4种GSDMC同源蛋白(GSDMC1-4)；GSDMs(除DFNB59外)均含有高度保守的N-末端和C-末端；GSDMD是首个鉴定出的焦亡经典和非经典的直接执行者[9-10]。完整的GSDMD没有生物活性，Caspase-1和Caspase-11/4/5特异性剪切GSDMD，将N-末端从具有自我抑制作用的C-末端释放出，GSDMD-N具有与脂质结合和成孔的能力，当招募至胞膜后，导致膜离子通道形成，细胞渗透性肿胀，最终细胞膜破裂并伴随大量炎性因子释放，此外，GSDME也是一个焦亡执行者，其可以被Caspase-3特异性剪切[11-12]。

3 焦亡在心血管疾病中的作用

心血管疾病发生率和致死率极高。焦亡通过介导炎症反应和细胞死亡，在心血管疾病的发生发展中发挥重要作用。焦亡相关的分子亦影响着心血管疾病的进程和结果。

3.1 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS) AS是一种脂质在主动脉沉积形成斑块，阻碍血液流动的慢性进行性疾病。AS涉及内皮细胞功能失衡、低密度脂蛋白(LDL)积聚和氧化、单核细胞和淋巴细胞募集、平滑肌细胞迁移和增殖、炎性因子激活、血小板聚集。在这些过程中炎症反应发挥着重要作用。研究发现，焦亡通过炎性因子及对斑块形成的影响而影响着AS的发生和进程。Salidroside通过抑制Caspase-1的激活、IL-1β的释放、降低GSDMD的表达，进而抑制内皮细胞的焦亡，减少动脉粥样斑块的形成[13]。研究发现，NLRP3炎性小体在内皮细胞和巨噬细胞的激活影响AS，尼古丁可以导致高脂饮食的ApoE-/-小鼠形成更大的AS斑块，但沉默NLRP3或凋亡相关斑点样蛋白(ASC)后，尼古丁诱导的主动脉内皮细胞Caspase-1的激活、IL-18和IL-1β的生成及凋亡被抑制[14]。成纤维细胞生长因子21亦通过抑制NLRP3炎症小体减轻焦亡而改善AS[15]。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人巨噬细胞死亡在AS形成不稳定斑块中发挥着重要作用，沉默巨噬细胞线粒体膜外蛋白NIX后，Caspase-1激活、IL-1β表达上调、NLRP3增加，NIX可以抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡而改善AS[16]。但是也有研究发现，NLRP3对AS的进程无影响。敲除NLRP3的高脂饮食ApoE-/-小鼠AS模型的AS进程、巨噬细胞对斑块的浸润和斑块的稳定并没受到影响[17]。

3.2 缺血性心脏病 心肌梗死(myocardial infarction，MI)主要是由于冠状动脉的急性闭塞，长时间缺血导致心肌细胞死亡。这涉及如凋亡、坏死及严重的炎症反应。研究发现，焦亡及其相关因子在心肌细胞、心脏成纤维细胞和巨噬细胞的变化影响着MI。NLPR3炎症小体在心脏缺血再灌注损伤后的形成中分成两步：首先NLPR3炎性小体的组分表达增加；在急性心肌梗死(AMI)发生后6～24 h NLRP3炎症小体逐渐增加，介导AMI的后期损伤；再灌注发生后立即或1 h使用NLPR3抑制剂能够降低梗死面积，在3 h时使用无此效果[18]。AMI病人及大鼠的中性粒细胞NLRP3凋亡小体、Casapse-1激活，释放IL-1β，进而导致心肌细胞和心脏成纤维细胞的IL-1R表达上调，加重炎症反应，最终心肌细胞凋亡及纤维化[19]。血中高水平髓系细胞触发受体-1(myeloid cells trigger receptors 1，TREM-1)，低水平sirtuin 6(Sirt6)增加了AMI病人2年随访的死亡率和不良心血管事件的发生，这与抑制Sirt6诱导的凋亡后导致TREM-1介导的血管内皮细胞焦亡相关[20]。

氧化应激在AMI后的心肌细胞死亡中也发挥着重要作用，研究发现，焦亡和氧化应激通过核因子-κB(NF-κB)共同影响着心肌细胞的死亡。NF-κB是GSDMD的重要转录调控因子。缺血缺氧条件下，通过N-acetyl-cysteine抑制氧化应激后，心肌细胞的NF-κB、GSDMD和NLRP3炎性小体的激活及焦亡受到抑制，此外，使用pyrrolidine dithiocarbamate抑制NF-κB后降低了GSDMD的转录和激活，继而抑制了NLRP3炎性小体介导的心肌细胞焦亡[21]。这说明NF-κB/GSDMD轴作为桥梁影响着氧化应激和NLRP3凋亡小体介导的焦亡。但在巨噬细胞中NF-κB直接介导NLRP3的表达[22]。

3.3 糖尿病性心肌病(diabetic cardiomopathy，DCM) DCM与心脏的慢性炎症紧密相关，最终导致心力衰竭。在此过程中，心脏出现结构和功能的异常，如心肌细胞功能失调、死亡，心肌成纤维化，左心室功能紊乱，代谢失调。高糖引起的炎症级联反应和氧化应激反应在糖尿病并发症中发挥着重要作用。NLRP3是DCM的一个生物标志物，沉默NLRP3减轻了2型糖尿病大鼠DCM的进程[23]。ELAV-like protein 1(ELAVL1)在炎症反应和心力衰竭中扮演着重要角色，糖尿病病人心脏和高糖处理的心肌细胞ELAVL1表达明显上调；同时Caspase-1、IL-1β也显著上调，敲除ELAVL1或通过miR-9靶向抑制其表达后NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达下调，抑制了TNF-α介导的经典途径凋亡[24]。抑制活性氧后，高糖处理的心肌细胞黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)表达下调；或沉默AIM2后，ASC、GSDMD-N、Caspase-3和IL-1β表达下调而减轻心肌细胞焦亡，改善代谢紊乱、心室重构导致的心脏功能紊乱[25]。

非编码RNA包括miRNAs、LncRNAs和circRNAs，在疾病的进程中具有重要作用。miR-30d在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠心脏和高糖处理的心肌细胞中上调，抑制Forkhead box O3(Foxo3a)导致凋亡抑制因子表达降低、Caspase-1激活、IL-1β和IL-18增加，促进心肌细胞焦亡[26]，而miR-9具有抑制心肌细胞焦亡的作用[24]。Yang等[27]发现LncRNA KCNQ1OT1在糖尿病小鼠左心室及高糖处理的心肌成纤维细胞中表达升高，KCNQ1OT1促进GSDMD剪切、IL-1β释放，下调KCNQ1OT1通过miR-214-3p/Caspase-1/TGF-β1通路改善了心肌细胞焦亡和纤维化。Caspase-1 associated circRNA(CACR)亦通过miR-214-3p/Caspase-1通路调节高糖致心肌细胞焦亡[28]。

3.4 其他心血管疾病 尿毒症性心肌病是慢性肾衰竭的主要并发症之一，约50%慢性肾脏疾病病人出现该症状，心脏出现肥大、纤维化、炎症和代谢重构[29]。尿毒症小鼠模型心脏浸润的巨噬细胞释放含有miR-155的外泌体被心肌细胞吸收后，释放出的miR-155靶向Foxo3a促进了心肌细胞的凋亡及其他变化[29]。多种刺激可以导致心脏形成生理性或病理性心脏肥大。最初的肥大是适应压力过载，但持续性的压力最终导致心力衰竭。体内外心脏肥大模型Caspase-1和IL-1β表达量均上调，抑制Caspase-1可以降低血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的作用[30]。

4 靶向焦亡相关分子的心血管疾病治疗药物

4.1 NLRP3炎性小体抑制剂 秋水仙碱是治疗痛风的常用药物。研究发现，其通过抑制NLRP3炎性小体而抑制炎症，急性冠脉综合征病人服用秋水仙碱后，单核细胞Caspase-1表达下调，抑制了IL-1β的分泌[31]。另一项研究中，与2 379例安慰剂组AMI病人相比，2 366例AMI病人经过中位数22.6个月低剂量秋水仙碱治疗后，复发缺血性事件显著降低[32]。但非ST段抬高型AMI病人使用秋水仙碱后炎症反应和梗死面积并未改善[33]。

Dapansutrile是特异性NLRP3炎性小体抑制剂，其可缩小小鼠心脏梗死面积和抑制左心室收缩功能障碍[34]。

体外研究发现，阿托伐他汀通过抑制NLRP3炎性小体发挥抗炎作用[35]。冠状动脉疾病病人使用阿托伐他汀8个月后，其NLRP3炎性小体和IL-1β、IL-18表达显著下调[36]。他汀类药物可能对冠状动脉疾病内皮细胞功能障碍具有改善作用。

4.2 IL-1β抑制剂 阿那白滞素是一种重组IL-1受体拮抗剂，抑制IL-1α和IL-1β的激活，被批准用于治疗由于NLRP3炎性小体异常激活、IL-1β上调而发生的Cryopyrin蛋白相关周期性综合征(cryopyrin-associated period syndromes，CAPS)。Ⅱ期临床试验表明阿那白滞素能改善ST段抬高型AMI病人和射血分数降低型心力衰竭病人病情，并成为治疗复发性心包炎的二线用药[37]。

卡那单抗是作用于IL-1β，但对IL-1α无作用的人源化单克隆抗体，亦被批准治疗CAPS，在长达 6 年并且有10 061例AMI病人参与的Canakinumab Anti-inflammatory Thrombosis Outcomes Study研究数据证明，心血管相关的死亡率降低15%，但并未被批准用于治疗心血管疾病[38]。

利纳西普是一种可溶性IL-1受体诱捕拮抗剂，与IL-1β结合力极强而抑制其活性，也是CAPS治疗药物。临床试验发现，利纳西普可降低AS病人血液C-反应蛋白(CRP)水平，减轻炎症，改善血管功能，Ⅱ期临床试验显示出对复发性心包炎良好的治疗效果，Ⅲ期试验正在进行中[39]。

5 小 结

NLRP3炎性小体介导的焦亡在心血管疾病中广泛研究，其参与了心肌细胞、心肌成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等细胞的焦亡和炎症反应。抑制炎症反应对心血管疾病的疾病进程具有临床受益。数种NLRP3炎性小体抑制剂的效果已经通过体内外试验验证，但是该靶点的药物目前并未上市，其临床效果仍需临床试验进一步观察。焦亡通路中的其他分子如Caspase-1、IL-1、IL-1β也可能是治疗心血管疾病的重要靶点，大规模的临床试验已经证实IL-1β的临床受益。但是大部分焦亡相关抑制剂在人体中的作用并不明确。因此，仍需进一步探究焦亡的机制及其对心血管疾病进程的影响，发现更多的靶点和治疗药物。