MicroRNA在肺小结节鉴别诊断中的研究进展

侯雅超，陈昌国，韩瑞

2022年全球最新癌症统计数据显示，肺癌发病率虽不是首位，但致死率高达21%，仍居第一[1]。我国最新统计数据显示，肺癌发病率及致死率仍为首位，2016年我国新肺癌82.8万例，约占总发病人数的20%[2]。

组织学上，肺癌主要分为小细胞肺癌（smallcell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non-smallcell lung cancer,NSCLC），NSCLC占肺癌总病例数的80%以上[3]。肺癌起病隐匿，不易发现，早期无明显临床症状，主要表现是影像学提示的肺部小结节。肺癌致死率较高重要原因之一是缺乏早期特异性临床症状，多数肺癌患者首次诊断时已处于晚期，预后相对不好[4-5]。研究表明，IA期肺癌患者5年生存率约77%～92%，而IVA期肺癌患者5年生存率仅为10%[6]。因此，寻找有效、准确的手段来提升肺癌早期诊断率，对于改善肺癌患者预后、延长生存期尤为必要。

低剂量计算机断层扫描(low-dose computed tomography,LDCT)是目前肺癌早期筛查的主要手段。随着人们健康意识的提升及诊断仪器分辨率的增高，肺部影像学检查中发现不明原因小结节的数量逐渐增多。肺部小结节在普通人群中检出率最高可达8%，高危人群甚至可达50%[4]。LDCT筛查虽在临床广泛应用，但较高的假阳性率易导致过度治疗[7]。此外，LDCT对于恶性肺小结节诊断的准确率与影像医生及胸外科医生读片水平密切相关，对其自身积累的临床经验有较高的依赖性[8]。那么，提高肺小结节检出率的同时，如何合理判断肺小结节良恶性成为肺癌早期筛查和诊断的关键问题之一。肺结节（特别是＜10 mm的肺小结节）进行组织活检有一定难度，如何有效利用非有创诊断手段提升LDCT筛查的准确率是亟需解决的问题。液态活检作为体外诊断的一个分支，以非侵入式获取血液及体液中相关标志物检测信息，是肿瘤早期诊断、辅助治疗的突破性技术[9]。随着液体活检技术的兴起及部分microRNA用于结直肠癌、肝癌早期诊断临床产品的应用，microRNA用于肿瘤早期诊断、鉴别诊断、预后评估等又成为肿瘤标志物的研究热点。microRNA是一类小的单链内源性非编码RNA，是液体活检的重要成员[10]。microRNA通过调控细胞周期、肿瘤细胞的侵袭和转移、肿瘤相关血管生成、肿瘤细胞代谢和细胞凋亡等过程,从而可促进或抑制肿瘤的发生、进展[11]。microRNA在肺癌早期诊断方面的应用亦有较多研究，可用于肺癌液体活检的标本有外周血、痰液和支气管肺泡灌洗液等[4]，这些标本具有相对易于获得、可重复采样和非侵入性的优势。本文就近年来microRNA在肺小结节鉴别诊断方面的研究进展进行综述如下。

1 MicroRNA

microRNA是一类18～22个核苷酸长的内源性非编码RNA。大多数动物体内发现的microRNA可与目的基因mRNA 3'UTR形成完全或不完全碱基配对，从而促进靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻译[12-13]。研究表明，microRNA可在细胞凋亡、分化和增殖等多个阶段参与靶基因表达调控，且microRNA异常表达与肿瘤细胞增殖、转移、侵袭和血管生成等生物学过程密切相关[14]。microRNA以下几个特点使其具备成为肿瘤标志物的“潜质”：（1）在进化过程中高度保守；（2）在生理或病理条件下可由正常细胞分泌到体液中，也可由凋亡或坏死细胞释放到体液中，从而进入体液循环；（3）在血清、血浆、尿液、乳汁和胸水等体液中均可检测到特异性microRNA；（4）肿瘤细胞和相应正常组织中均有特异性microRNA表达谱，且特异性microRNA表达谱与肿瘤进展阶段高度一致[15]；（5）不同体液中microRNA相对稳定，与其能和蛋白结合形成复合物有效抵抗RNase降解有关；（6）体液中游离microRNA可耐受煮沸、高/低pH、RNase等处理，甚至在反复冻融多次、室温放置24 h等严苛情况下其含量仍保持相对稳定[16]。

2 MicroRNA与肺癌

肺癌早筛是一项重要的公共卫生问题。为改善肺癌“两低一高”（早期检出率低，5年生存率低，病死率高）现状，完善和落实肺癌早发现、早诊断和早治疗策略，除努力提高LDCT诊断效率外，一些出现的新技术可作为实验室检测的手段[17]。液态活检技术就是一种较好的补充，利用液体活检技术可检测到不同进展阶段及不同肿瘤部位释放的生物标志物，实现实时监测肿瘤细胞相关分子变化的目的，较为全面反映恶性肿瘤不同分子表达谱变化，可较好解决肿瘤异质性给肿瘤早期诊断带来的挑战[18]。microRNA作为液体活检的重要成员，越来越多的研究团队将microRNA应用于肺癌早期筛查及诊断，作为LDCT的补充辅助诊断方法，单独或联合应用以提高肺癌早期诊断准确率。

2.1 MicroRNA在肺癌早期诊断中的价值在过去几年中，基于循环中microRNA检测用于肺癌早期诊断的研究较为广泛，研究结果均提示microRNA可作为肺癌早期诊断，且具有良好的敏感性和特异性[19]。Monika等[20]对NSCLC组织和癌旁组织中差异microRNA检测发现，NSCLC组织中miR-17表达显著低于癌旁对照组（P=0.0178），随后，他们通过ROC曲线分析进一步明确miR-17在早期诊断NSCLC方面具有较大价值，认为miR-17可用于区分肿瘤组织与手术切缘，且miR-17表达水平与NSCLC组织型分化程度呈一定相关性。Ernest等[21]对70例肺癌患者和22名非癌症受试者(non-cancer subjects,NC)血清样本microRNA表达谱分析发现，miR-193b、miR-301、miR-141和miR-200b这4个microRNAs可有效区分肺癌患者与NC患者，认为这组microRNAs有较大潜力作为LDCT前实验室辅助筛查的生物诊断标志物。此外，有关microRNA对于NSCLC诊断价值的Meta分析亦有较多报道。Cheng等[22]分析发现，miR-148/152家族对于诊断NSCLC具有良好的敏感性和特异性，可作为NSCLC诊断的新型无创诊断生物标志物。microRNA SNP与肺癌易感性亦有少量报道，Zou等[23]发现miR-155和MIR155HG rs767649多态性是NSCLC易感性的潜在因素，但缺乏较为严谨、确凿的实验证据，其具体分子机制有待进一步研究。

此外，不同组织来源肿瘤细胞和对应组织均有各自特征性microRNA表达谱。Pavel等[24]通过NGS技术对肺癌患者和良性对照组主支气管上皮细胞microRNA表达谱测序发现，肺癌患者支气管上皮细胞中miR-146a-5p、miR-324-5p、miR-223-3p、miR-223-5p下调；进而将miR-146a-5p与现有肺癌肿瘤标志物联合用于肺癌早期诊断，证实可显著提高诊断效能。有学者尝试将痰液中microRNA检测作为肺部结节的诊断标志物。Roa等[25]对NSCLC患者痰液中miR-21、miR-145、miR-155、miR-205、miR-210、miR-92、miR-17-5p、miR-143、miR-182、miR-372和let-7a进行检测，发现miR-21、miR-143、miR-155、miR-210、miR372可有效区分NSCLC患者，将这组microRNAs前瞻性应用于24例NSCLC病例和6例阴性对照病例，结果提示这组microRNAs用于NSCLC诊断，其灵敏度为83.3%，特异度为100%。

2.2 MicroRNA与肺癌预后microRNA不仅可用作肺癌辅助诊断，还可用于肺癌治疗效果评价及预后评估。Xu等[26]通过检测43例NSCLC患者1个周期铂类药物化疗前后血浆中miR-32表达量，结果表明血浆miR-32表达水平与患者铂类药物化疗效果及患者生存期有一定相关性，认为miR-32检测可用于预测NSCLC患者铂类化疗疗效和预后评估。Yang等[27]检测73例肺腺癌患者癌组织和癌旁组织中miR-421表达量，运用Kaplan-Meier生存曲线进行分析表明，miR-421表达水平较高的肺腺癌患者总生存期(overall survival,OS)较miR-421表达水平低的microRNA患者要低，miR-421高表达是肺腺癌不良预后的独立预测因子。

3 MicroRNA与肺结节鉴别诊断

目前，组织活检是肺癌确诊的金标准，但这类活检手术有引起严重并发症的风险，如气胸、肺实质出血、肺部感染等[28]。临床操作中，当肺小结节直径＜10 mm，进行组织活检难度较大，造成漏诊、误诊的机率大幅增加。LDCT是现阶段肺癌筛查和早期诊断的有效方法之一，但随着假阳性结节大量检出，需要其它筛查手段加以补充以提高肺癌早期诊断准确率。

目前，众多研究均认为microRNA在肺结节中早期诊断中有较大价值，且可作为鉴别良恶性小结节的肿瘤标志物[29-30]。He等[8]联合检测血清miR-199a-3p、miR-148a-3p、miR-210-3p、miR-378d和miR-138-5p发现microRNAs检测有助于降低CT扫描诊断的假阳性率，提高LDCT鉴别肺良恶性结节的诊断效能。Xi等[31]对57例接受手术的肺结节患者（15例良性肺结节患者和42例恶性肺结节患者）血浆中12种microRNAs表达水平进行检测，发现NSCLC患者血浆中miR-17、miR-146a、miR-200b、miR-182、miR-221、miR-205、miR-7、miR-21、miR-145和miR-210表达水平显著高于良性肺结节患者，且这些microRNAs均有较高灵敏度（54.8%～83.3%）和特异度（60.0%～86.7%）；该团队继而从这 组microRNAs中 选 取miR-146a、miR-200b和miR-7与LDCT联合建立诊断模型并对该模型诊断肺结节的性能进行评估，结果表明该诊断模型在训练集中对NSCLC诊断的灵敏度和特异度分别为92.9%和83.3%；验证集中对NSCLC诊断的灵敏度为71.8%，特异度为69.2%，显示出良好的诊断效能，可有效辅助辨识肺结节性质[32]。

尽管有研究认为凝血过程可能影响血清中microRNAs水平，但较多研究亦采用血清作为检测microRNA的介质[4]。除直接进行检测外，有学者尝试利用microRNA检测值比率用于肺小结节的鉴别诊断。Fan等[33]对正常对照组和NSCLC组miR-15b-5p/miR-146b-3p、miR-20a-5p/miR-146b-3p、miR-19a-3p/miR-146b-3p、miR-92a-3p/miR-146b-3p和miR-16-5p/miR-146b-3p比值进行了分析，发现NSCLC组microRNA组合比值显著高于良性肺结节组，认为这五种血清microRNAs组合比值是鉴别良性肺结节和NSCLC的独立诊断因素。

外泌体是一种微型载体，可用于microRNA动员、保护和运输microRNA，并通过将其内容物运输到肿瘤微环境中的靶细胞来影响细胞间通讯。因此，外泌体来源microRNA被认为是理想的循环肿瘤标志物之一[17]。肿瘤来源的外泌体在肿瘤发生、发展、诊断和治疗中发挥重要作用[34]。有研究表明，外泌体microRNA可以有效区分不同亚型的NSCLC，如腺癌和鳞癌[35]，因此有研究提出外泌体来源microRNA可作为NSCLC的潜在诊断生物标志物[36]。Gao等[17]利用NGS测序技 术分析 了254例早期肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）患者、76例良性肺结节（benign pulmonary nodules,BPNs）患者和130名健康对照患者（healthy control patients,HCs）血浆样本中外泌体microRNA表达谱，建立诊断特征模型并进行多中心验证发现，miR-106b-3p、miR-125a-5p、miR-3615和miR-450b-5p组成的诊断特征组合可用于LUAD的早期检测。Zhang等[36]同样利用血浆外泌体来源microRNA构建SVM(support vector machine)诊断模型并验证，发现SVM模型可准确区分肺良性结节和肺恶性磨玻璃结节。Yang等[37]使用血清外泌体提取试剂盒从外周血血清中提取外泌体，然后通过RT-PCR检测了miR-21和Let-7a水平，结果表明miR-21/Let-7a在NSCLC患者的AUC曲线下面积为0.7539；灵敏度和特异度分别为56.00%和82.61%，具有较好的鉴别诊断效能。

4 总结与展望

综上所述，LDCT在准确鉴别诊断肺部结节良恶性方面存在较大挑战，尤其是直径＜10mm的肺小结节。液体活检技术的出现与发展为肺小结节良恶性鉴别诊断提供了一种新的无创方法。microRNA作为液体活检的重要成员，可作为LDCT联合诊断的实验室手段来提高LDCT诊断效能。然而，目前microRNA相关研究尚存在一定的局限性，如：（1）大多数为样本量较小的回顾性研究对结论的推论有一定影响；（2）手术的良性肺结节患者比例相对较低，会降低诊断效率[32]。（3）大多数研究为单中心验证诊断模型，需要多中心及更大样本量的验证。随着，用于结直肠癌早期筛查miR-92a检测试剂盒及肝癌microRNAs检测组合试剂盒的上市，特征性microRNA作为不同癌种早期筛查的临床前景也越来越被看好。相信，随着microRNA在区分良恶性肺小结节方面研究的不断积累，未来microRNA有望与LDCT联合用于肺部结节的良恶性鉴别诊断，以期提高肺小结节的鉴别诊断效率。