大连地区先兆性流产与亚甲基四氢叶酸还原酶多态性关系的研究

孙绍华，刘莹，于海华

（大连市妇女儿童医疗中心（集团）遗传代谢医疗中心，辽宁 大连 116000）

叶酸是人体自身不能合成的重要营养素，属于B族的水溶性维生素。经过肠道吸收的叶酸通过亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）转化生成5-亚甲基四氢叶酸，不仅可提供同型半胱氨酸的代谢过程中所必须的甲基供体，同时在细胞周期等生命活动中具有重要作用，参与DNA 氧化损伤修复、组织的生长、细胞的增殖、蛋白质代谢等活动，与维生素B12共同作用促进红细胞的生成、成熟[1-2]。同型半胱氨酸代谢途径的关键酶由于基因突变导致MTHFR基因677C/T多态性有3个基因型，分别是CC型（野生型）、CT 型（杂合突变型）及TT 型（纯和突变型），MTHFR酶活性降低会导致同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转化率降低，因此，同型半胱氨酸在TT基因型的人群中水平会显著增高，高同型半胱氨酸对胚胎发育有一定的影响，可能会导致唐氏综合征、神经管畸形、先天性心脏病等出生缺陷；同时，妊娠期高血压、胎盘早剥、反复流产、先兆子娴等孕期疾病的发生可能与血浆中同型半胱氨酸水平升高有一定的相关性[3]。先兆性流产[4-5]是一种较常见的孕期症状，是指在孕28 周前阴道出现少量的流血，继而出现阵发性下腹疼痛或腰痛，经盆腔检查子宫口未开胎膜完整，无妊娠物排出，症状严重者，可能发展为流产[6-7]，对孕妇及家属造成较大的心理伤害。本研究旨在检测本地区叶酸代谢相关的基因MTHFR多态性的分布情况，分析本地区育龄女性先兆先流产与MTHFR 多态性的相关性，以期为预防本地区孕妇先兆性流产及孕期叶酸补充提供指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年4月至2020年5月于本院就诊的380例先兆流产患者作为先兆流产组，另选取同期孕期各项检测指标均正常且无任何不良妊娠疾病的孕期女性508名作为正常对照组。所有研究对象孕龄均＜13 周，年龄22～40 岁。研究对象均签署叶酸基因检测知情同意书，抽取外周血于EDTA 抗凝管保存。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法1.2.1 设备与试剂 Fluorescent Quantitative PCR Detection System 荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测系统9600 系列。亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购于泰乐德医疗有限公司。

1.2.2 检测方法 取EDTA 抗凝管中50 μl 全血样本加入1.5 ml离心管中，加入150 μl氯化铵、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸混合液沉淀DNA，14 000 r/min离心2 min，弃上清，加入150 μl 十二烷基硫酸钠和蛋白酶K混合液进行洗涤，14 000 r/min离心2 min，弃上清，加入50 μl 裂解液混匀65°C 水浴5 min，最后加入15 μl含有三羟甲基氨基甲烷、碳酸氢钾的稳定液，混匀后检测DNA检测浓度。八连管反应孔中加入预配置好的PCR扩增体系（氯化镁、Taq酶，探针，脱氧核苷酸等）16 μl，分别加入4 μl 的待检测样本DNA，同时做好阴性阳性对照。探针：MTHFR1-F 5’-CGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3，MTHFR1-R 5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3。

将上述放入反应管放入荧光定量PCR 扩增仪中，扩增程序如下：50 ℃2 min，95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，45个循环，扩增反应完成后，收集荧光信号进行检测结果分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验 对两组MTHFR基因多态性分布数据进行遗传平衡检验，样本有区域代表性符合Hardy-Weinberg 遗传平衡规律，可以对收集到的数据进行比较和分析。

2.2 两组MTHFR 的基因型构成与基因频率比较正常对照组的MTHFR C667T 位点野生CC 型占21.6%，杂合突变CT 型占48.2%，纯合突变型TT 型占30.2%；先兆流产组MTHFR C667T 位点野生CC型占17.9%，杂合突变CT 型占47.3%，纯合突变型TT 型占34.8%，两组MTHFR C677T 基因型构成比较差异无统计学意义。

正常对照组突变基因T 的基因频率为54.3% ，C的基因频率为45.7%；先兆流产组突变基因T的基因频率为58.4% ，C的基因频率为41.6%。两组C、T等位基因型频率分布比较差异无统计学意义。

3 讨论

叶酸的代谢吸收在胎儿生长发育过程中十分重要，妊娠期间孕妇对叶酸的需求量是普通人群的4 倍，人体内叶酸、同型半胱氨酸的水平与MTHFR基因多态性相关，如叶酸代谢酶活性降低导致同型半胱氨酸水平升高可能会引发妊娠期孕妇复发性流产、胎盘早剥、妊娠高血压及胎儿神经管畸形等出生缺陷[8]。同型半胱氨酸代谢途径的关键酶MTHFR[9]能够催化5，10 -亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，可为同型半胱氨酸代谢提供甲基，因此，能够降低同型半胱氨酸水平。MTHFR基因位于1 号染色体q36.3，长度约为2.2 kb，共有11个外显子，已发现MTHFR有20余种基因多态性的突变位点，最常见的是第5 外显子上677 位点的突变，此位点的胸腺嘧啶替代了胞嘧啶，在体内形成CC 型、CT 型及TT 型3 个基因型，MTHFR 酶的活性降低是由于此突变导致丙氨酸突变为缬氨酸所致。有研究指出在CT 基因型（杂合突变型）人群中MTHFR 酶活性降低约35% ，在TT 基因型（纯合突变型）人群中MTHFR 酶活性降低50%～70%[10]，MTHFR酶活性降低，导致血浆中同型半胱氨酸增高，可能会引发一系列出生缺陷。

本研究对该地区先兆流产的女性和孕期表型正常的女性进行MTHFR 基因多态性检测，结果显示，先兆流产组与正常对照组MTHFR基因型构成、等位基因分布结果比较差异均无统计学意义。提示，本地区MTHFR C677T位点生突变与先兆流产并无明显相关性，引起先兆流产的因素复杂多样，受环境、营养状况和遗传因素的共同影响，尚需进一步分析检测。

目前，我国推行的孕期保健措施是指导孕妇在孕前3 个月至孕早期3 个月每天补充0.4 mg 的叶酸，在叶酸摄入无差异的情况下，由于MTHFR 突变，TT型、CT型个体相较于CC型个体，体内叶酸水平降低20%左右，导致部分孕妇叶酸缺乏，进而使子代存在神经管畸形、唐氏综合征及心脏畸形等风险[11-13]，通过对备孕女性或者孕早期女性进行MTHFR C677T 基因遗传学检测，并根据本地区叶酸代谢基因型分布的特点，因人而异制定个性化的叶酸补充方案，对遗传上存在叶酸代谢障碍风险的人群（如TT 型）指导其增加补充叶酸剂量，帮助孕期女性合理补充叶酸，能有效达到预防出生缺陷的目的。