高分子材料在髓核组织工程中的应用与研究

祝昊，尚晖，张洋，陈瑞，沈天宇，向治成

（湖北医药学院附属太和医院 脊柱外科，湖北 十堰 442000）

椎间盘退行性病变（intervertebral disc degeneration,IDD）是导致下腰痛的常见原因，全球有80% 以上的人都受到了相关问题的困扰［1］，同时也成为全球致残和巨大医疗开支的重要原因［2］。腰椎间盘由髓核（nucleus pulposus,NP）、纤 维 环（annulus fibrosus,AF）以 及 终 板（endplate）三部分组成，随着年龄的增加，椎间盘的组成成分和微观结构会发生一定的变化，如髓核因结合水的能力降低而收缩变小，进而导致椎间盘在承受负荷时纤维环出现受损或分层，加速椎间盘及其周围组织的退行性变化，造成严重的后果。目前针对这种疾病的治疗手段主要有两种，第一种是通过药物或其它物理疗法进行保守治疗，第二种是通过手术的方式进行椎间盘的切除，达到解除压迫，缓解症状的目的。尽管手术方式多样［3］，但手术会造成自身及相邻组织的进一步退变，远期预后不佳［4］。因此，解决退变组织内的炎症问题［5］，减少功能细胞的损失，恢复细胞外基质含量，才能实现有效的治愈。细胞椎间盘退变的逆转对脊柱健康有潜在的巨大影响［6］。在这样的背景下，通过组织工程的手段对已损伤的椎间盘进行修复受到了更多的关注，相关领域的探索、创新也在不断进行。

高分子材料的应用是组织工程的重要组成，以高分子材料为载体，模仿髓核的理化性质，配合种子细胞、生长因子的研究在近些年取得了较大的进展。目前大多数研究中，高分子材料主要用于构建支架，作为细胞移植的载体。集成3D 生物打印技术制备载细胞腰椎间盘支架也有一定的可行性［7］。本文从高分子材料在治疗椎间盘退变的应用上分析，结合近几年的研究作一个综述。

1 高分子材料作为支架材料的应用

高分子材料作为移植细胞的载体，可以为植入的细胞提供适宜的生存环境，以保证移植细胞植入后的效果。另外，治疗椎间盘退变的组织工程结构必须适应缺氧和炎症退变的椎间盘微环境［8］。目前常用作载体的高分子材料主要分为天然材料与合成材料两种，通常结合分子交联等手段形成互穿聚合物网络水凝胶［9］。

1.1 天然材料

用于构建髓核支架的天然高分子材料主要有胶原、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠等。由它们参与构成的水凝胶是组织再生的有效结构［10］。天然材料与植入细胞之间可以产生良好的联系［11］，使其拥有更加广阔的应用前途。

壳聚糖（chitosan,CH）化学名称为聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-B-D 葡萄糖，拥有良好的生物官能性和相容性，在体内也有较高的安全性，同时，被证明可以用于增加复合材料的强度［12］。KUANG等［13］利用脱细胞髓核基质与壳聚糖组成的混合水凝胶培养髓核干细胞，发现添加了生长因子的混合水凝胶中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的基因表达得到增强。ADOUNGOTCHODO等［14］在基于壳聚糖的水凝胶中添加了名为Link N的天然肽后，发现补充有LN 的壳聚糖水凝胶可以帮助在椎间盘退化的早期阶段恢复NP 的功能。YUAN 等［15］用壳聚糖水凝胶作为在体外构造的组织工程椎间盘的髓核支架，发现其很好地满足椎间盘的天然结构以及力学的相关要求。ALINEJAD等［16］研究了几种新型的温敏性壳聚糖水凝胶，这些新型水凝胶是由CH 与三种胶凝剂（碳酸氢钠和/或β-甘油磷酸和/或磷酸盐缓冲液）的不同组合混合而成，通过测量植入的髓核细胞存活率、新陈代谢和蛋白多糖的合成来评估水凝胶的细胞相容性和功能，发现了能更好表现出与人NP 组织相似的力学性能，并能更好地刺激NP 细胞蛋白多糖的合成和保留的温敏性壳聚糖水凝胶。SCHMITT等［17］选择10 只椎间盘受损的绵羊，每只均有3个椎间盘受损，采用注射的方式给每只绵羊的2个椎间盘注入装载脂肪来源干细胞（adiposederived stem cells,ASCs）的壳聚糖羧甲基纤维素水凝胶支架，12 个月后，与未治疗的受损IVD 相比，治疗后的椎间盘高度稳定，退行性变进展明显减轻。

透明质酸（hyaluronic acid,HA），又称糖醛酸、玻尿酸，是一种由双糖（D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺）基本结构组成的糖胺聚糖，是结缔组织、上皮组织、神经组织和天然细胞外基质的主要成分［18］，它的透明质分子具有吸收500 倍体积以上水的能力。RAJAN 等［19］发现利用石墨烯、壳聚糖以及透明质酸制得的复合材料支架，相对于普通透明质酸水凝胶具有更有利于种子细胞存活及分化的胶孔隙率、密度、溶胀等特性。YAMAMOTO 等［20］发现了透明质酸可以通过调节p38 和ERK1/2 通路抑制椎间盘退变，改善椎间盘的炎症情况。KAZEZIAN 等［21］证明了透明质酸作为一种抗炎分子，通过将椎间盘环境转变为更多的合成代谢状态，并通过促进天然椎间盘(intervertebral disc,IVD)基质的产生而起到了抗炎分子的作用。CHEN 等［22］开发了一种光交联明胶-甲基丙烯酸透明质酸水凝胶用于培养脂肪基质细胞髓核样分化，发现这种培养条件下的脂肪基质细胞向髓核细胞分化效果良好，大鼠髓核基质明显增多，椎间盘高度指数明显升高。MOHD ISA等［23］在椎间盘损伤的大鼠模型中植入透明质酸水凝胶，发现透明质酸可以有效减轻炎症和疼痛。KIM 等［24］利用多孔聚己内酯及透明质酸水凝胶组建复合的组织工程椎间盘，并将其植入大鼠尾棘5周，观察到5 周后结构仍然保持完整。

海藻酸钠（sodium alginate,SA）是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其在医药领域用作生物可降解无毒材料［25］，拥有可以在温和辐射条件下加工的优势［26］。海藻酸盐在与生理环境接触时会凝胶化成更柔软的结构，从而限制了其在软组织再生中的潜力，不适合与承重身体部位相关的使用［27］。海藻酸钠易于阳离子形成凝胶，同时也可以在结构中加入多种有机材料增加其强度，海藻酸钠中的醛端基可以主导其与明胶的交联［28］。ERWIN 等［29］利用海藻酸钠水凝胶在3D 培养基中培养犬的脊索细胞，发现在缺氧的条件下，脊索细胞产生了与体内观察到的结构高度相似的结构。MIETSCH 等［30］比较了3D微球培养和海藻酸盐微球，以及不同培养基组成，通过加入人富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）或转化生长因子（TGF-1）在静水压作用下对人间充质干细胞与髓核细胞软骨分化的影响，发现在适宜因子的体外诱导下，海藻酸盐在支架的构建中可以发挥出理想的生物学作用。WANG等［31］以藻酸盐水凝胶为载体，比较不同种子细胞植入后的效应，发现相同条件下软骨终板来源的干细胞的成骨效应相较于纤维环或髓核来源的干细胞优越。TSUJIMOTO 等［32］发现超纯化海藻酸盐（ultra-purified alginate,UPAL）凝胶与人类IVD 细胞具有生物相容性，并在椎间盘切除术后促进细胞外基质的产生，显示出足够的生物力学特性而没有材料突出。URA 等［33］在椎间盘切除术的动物模型中，植入UPAL 凝胶，证明UPAL 凝胶植入抑制TNF-α 和IL-6 的产生，下调TrkA 的表达，抑制IVD 变性，减少伤害性行为。SUN 等［34］采用全氟三丁胺（perfluorotributylamine,PFTBA）作为海藻酸盐支架的氧气调节剂，发现富含PFTBA 的海藻酸盐可恢复椎间盘高度和细胞外基质含量，促进植入的髓核细胞的增殖。NAQVI 等［35］研究骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）在常氧（20%）和低氧（5%）条件下三维培养时对不同pH 环境［血液（pH 7.4）、健康椎间盘（pH 7.1）、轻度退变椎间盘（pH 6.8）和严重退变椎间盘（pH 6.5）］的反应。发现在低于pH 6.8 时，由海藻酸钠包裹的干细胞增殖出现障碍，细胞不能存活和积累髓核样基质成分（糖胺聚糖和胶原）。HUDSON 等［36］发现低氧（1%～5%O2）条件下培养三维结构可以增加原代IVD 细胞外基质成分的产生。DU 等［37］将以包裹NP 细胞的海藻酸钠水凝胶为核心的工程化IVD 植入物在裸鼠皮下植入后，发现随着时间的推移，显示出逐渐的组织形成，表现为细胞外基质的沉积和组织以及机械性能的增强。

还有一些天然材料也常应用于髓核的组织工程中。胶原（collagen）是髓核的重要组成成分之一。WANG 等［38］利用戊二醛交联型胶原构建一种新的人间充质干细胞培养和分化的支架，发现与Ⅰ型胶原相比，Ⅱ型胶原涂层板培养的干细胞表现出了sox-9、Ⅱ型胶原和aggrecan 基因表达的增加。XU 等［39］将髓核细胞封装在胶原蛋白水解物、明胶和甲基丙烯酸酯（GelMA）组成的光敏水凝胶中，通过调节GelMA 水凝胶浓度观察不同浓度下髓核细胞增殖、存活的状态，得到了最佳的水凝胶浓度（5%）。CHOY 等［40］用胶原蛋白和糖胺聚糖（glycosaminoglycans,GAGs）制作了一个双相支架，并且通过机械测试测得其恢复率（82%～89%）接近原生椎间盘（99%），并且动态刚度和阻尼系数与原生椎间盘相似。CHIK 等［41］以骨髓间充质干细胞和胶原等高分子材料为原料，采用基于模块的一体化方法构建具有复杂层次结构的多组分脊柱运动节段（spinal motor segmen,SMS），创造了研究组织成熟和功能重塑的三维模型。

通过脱细胞过程获得的脱细胞材料也可用作支架材料，这项技术的特点是其可以保持关键的天然细胞外基质（ECM）成分［42］。WU 等［43］通过脱细胞与冻干、交联的处理，制备了猪源脱细胞基质作为集成双相IVD 支架，荧光显微镜和扫描电镜显示，该支架为AF 和NP 细胞的黏附和增殖提供了合适的三维环境，在保留了大量的胶原蛋白的同时，提供了较好的力学性能。CHAN 等［44］利用脱细胞技术对牛IVD 进行脱细胞处理，构建完整的终板到终板IVD 支架，通过改变化学和物理脱细胞参数，实现了高达70%的内源性细胞的去除，并能够保存椎间盘的糖胺聚糖含量、胶原纤维结构和机械性能。

1.2 合成材料

目前常用的人工合成材料包括聚乳酸和聚乙醇酸等［44］。聚乳酸（polylactic acid,PLA）又名聚丙交醇，在体内可以降解为无害的乳酸，常用来作为人体的植入物。XIANG 等［45］利用聚乳酸支架共培养间充质干细胞和胎儿髓核细胞，在植入兔椎间盘12 周后，观察到植入细胞纤维样表型，附着在聚乳酸-羟基乙酸（polylactic acid-polyglycolic acid,PLGA）支架上时形态正常，说明PLGA 支架提供了可行的生长条件、力学性能和空间结构。KIM 等［46］开发了不同孔径的多孔聚乳酸-羟基乙酸支架，用于NP 细胞的培养，并研究了孔径大小对细胞生长和ECM 合成的影响，发现小孔隙内细胞密度高，通过相互连通的孔促进胶原合成和细胞迁移。大孔隙支架细胞增殖和胶原合成较慢。

医用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）又称聚环氧乙烷，在一般条件下有着良好的稳定性和温和性。NGUYEN［47］等合成了一类新型、结构清晰、机械强度可调的聚乙二醇基纳米复合水凝胶，压应力为24.2 MPa，压缩断裂应变大于98%，展现了强大的抗压能力。CHEN 等［48］通过四臂聚乙二醇（PEG-SH）与银离子溶液的Ag-S 配位作用，合成了一种具有可注射性、自愈性、抗菌、可降解性和高吸水性的PEG 水凝胶，发现其与椎间盘的作用机制完全匹配。JEONG 等［49］以羟基磷灰石（HA-SH）和聚乙二醇乙烯基砜（PEG-VS）大分子单体为原料，制备了8 种不同的水凝胶，并将其作为NP 和AF 细胞体外培养的基质，发现低分子量HA-PEG 水凝胶的NP 和AF 细胞数最高，而低分子量HA-PEG 水凝胶的NP 和AF 细胞数也较高。

其它诸如纳米高分子材料等。WAN 等［50］以生物相容性、可剪切性和纳米纤维结构为特征的新型自组装肽水凝胶（self-assembling peptide hydrogel,SAPH），作为髓核组织工程的细胞载体和支架材料，发现用其培养髓核细胞过程中，细胞存活率很高，同时，表型与体内的髓核细胞类似，活细胞群保持稳定。MA 等［51］设计的新型的RADA16-Link N 自组装肽支架材料，并将其与生物活性基序Link N 直接偶联，得到了Link N 纳米纤维支架材料（LN-NS），发现其能显著促进植入细胞的黏附与细胞外基质的积累。

2 高分子材料的其它应用

有一些研究尝试直接采用复合合成材料代替髓核。KHANDAKER［52］等使用电纺纤维固定在硅胶盘上，组成ENAS 盘，对植入ENAS 椎间盘的兔尾进行了离体机械测试，发现ENAS 椎间盘的粘弹性高于硅胶椎间盘，可与人类髓核的粘弹性相媲美。但该法不属于目前常见的组织工程方法研究范围，故在这里不作过多的叙述。

3 结语与展望

髓核具有优良的可塑性，其形态可随脊柱作各种运动时因重心不同而改变，起着类似轴承一样滚动支撑椎体的作用。在医用植入材料中，金属材料应用广泛，但其在体内的生物相容性与生物降解性仍存在一定的问题。基于水凝胶的新策略可能有助于揭示IVD 退行性疾病的新可能性。高分子材料具有良好的生物相容性，是目前髓核组织工程中用于构建支架材料的常用生物材料，也是目前最受关注的研究对象。胶原、透明质酸、海藻酸盐等材料制成的水凝胶给种子细胞适宜的生长环境，结合合适的生长转化因子，可以达到诱导分化的目的，对于控制炎症、提高椎间盘的含水量、补充细胞外基质以及恢复椎间盘高度有着十分重要的意义；合成材料的创新应用也给研究带来了更多思路与方向。由于椎间盘特殊的微观组成及力学特性，需要选择合适的方式对支架材料进行构建，进一步测量材料的动态性能，以满足力学强度的要求。在此基础上，选择种子细胞及适宜生长因子，最终构建完整的组织工程髓核，实现受累椎间盘的修复再生。目前构建的水凝胶载体多以注射的方式注入椎间盘组织内，虽然已有的研究证明了注射的安全性［53］，但注射造成的纤维环损伤及可能的退变仍然需要关注，除了注射工具的口径，注射的部位及路径还需要更多的实践证据。同时，也需要建立更多的动物模型，进一步探究通过组织工程手段治疗椎间盘退行性病变的时机，过早或过晚的干预都达不到预期的效果。目前许多组织工程手段如天然高分子的改性、合成高分子的制备等已广泛应用于临床，还有许多技术成果未来将应用于临床.所以，是否能够解决患者的疼痛问题应该被重视，疼痛可能来源于多方面，构建疼痛模型，观察治疗效果，也应作为目前研究的重点。