细菌外膜囊泡的抗肿瘤机制及其应用研究进展

陈欧亮，张 红，赵鑫铖，罗尹琳，岑怡静

(海南大学动物科技学院，海南海口 570228)

近年来，随着细菌用于抗肿瘤治疗研究的不断深入，研究人员发现由革兰氏阴性细菌产生的外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)也有着与其来源细菌类似的抗肿瘤作用，比如专性厌氧菌和兼性厌氧菌对肿瘤低氧区的特殊靶向性和激发抗肿瘤免疫反应等。而由于OMVs没有细菌的繁殖复制能力，在将其应用于患肿瘤动物治疗时将会展现比细菌更佳的生物安全性。此外，OMVs是纳米级别的小泡，更容易经血液传递和穿透组织，从而快速到达肿瘤组织发挥抗肿瘤作用。不仅如此，OMVs对各种生物工程改造有着极强的耐受性，比如超声、过滤挤压、电击等。通过改造，可以实现其肿瘤靶向性的增强，以及肿瘤治疗药物的高效运输。OMVs的给药方式也不是单一的，不同给药方式可以更好地满足不同肿瘤类型的治疗。总的来说，OMVs的生物和理化特性使其在肿瘤治疗上具有巨大潜力。

1 细菌外膜囊泡的抗肿瘤机制

1.1 OMVs是纳米级脂质双层囊泡结构

OMVs由各种免疫刺激成分组成的纳米级脂质双层囊泡结构(直径20 nm～250 nm)，是许多科学家公认的候选疫苗和药物递送载体的免疫刺激剂之一[1]。OMVs的大小利于其直接通过淋巴引流和吞噬进入淋巴结，随后由抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)携带，如OMVs的特殊纳米结构可以增加树突状细胞(dendritic cells，DCs)对其摄取[2]。据报道，在小鼠静脉注射OMVs后，能够在肿瘤组织中积累，诱导抗肿瘤免疫反应并最终根除肿瘤[3]。OMVs的脂膜成分使其在经皮给药时具有良好的透皮效果，可以广泛渗透进表皮和真皮层。因此是一种有巨大潜力的治疗各种皮肤疾病如皮肤癌和痤疮的靶向性纳米平台[4]。

1.2 OMVs携带细菌抗原

革兰氏阴性细菌在自然生长过程中会连续释放出OMVs，OMVs主要由细菌外膜成分组成，含有大量来自亲本细菌外膜和周质的物质，这些物质是可以诱导保护性免疫反应(包括抗肿瘤免疫)所需的关键抗原成分，OMVs所具有的高度免疫原性使它们成为激发天然免疫力和作为疫苗载体的极佳制剂[5]。

OMVs中丰富的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)可以激活免疫系统，适应性免疫反应的产生需要APCs发挥其功能，OMVs包含的PAMPs可以与APCs上相应的模式识别受体相互作用，从而激活APCs[1]。此外，PAMPs还可以激活Toll样受体(TLR)，从而引发强有力的炎症反应[1]。脂蛋白A是脂多糖的一个组成部分，是一种被TLR4和髓样分化因子2识别的磷酸化和酰化的二糖胺，在宿主天然免疫细胞上被识别。

OMVs携带细菌蛋白和毒力因子，包括可以介导与宿主细胞黏附的表面因子。已有研究表明OMVs携带的来自亲本细菌的毒性分子赋予了其一定的免疫调节能力，可以破坏体内B细胞的耐受性[6]。体内注射OMVs可以刺激参与抗肿瘤免疫反应的细胞因子的表达，如干扰素-γ(interferon γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6((interleukin-6,IL-6)等[7]。研究表明，OMVs能够诱导较高的抗原特异性抗体，并且比由重组蛋白或糖结合物佐剂组成的传统疫苗制剂具有更强的功能性[8]。来自沙门氏菌(Salmonella)的OMVs被发现可以诱导树突状细胞上CD86和主要组织相容性复合体Ⅱ类分子的表达，TNF-α和IL-12的产生，并促进保护性B细胞和T细胞反应的发展。有研究人员研究了单纯使用革兰阴性菌大肠埃希氏菌(E.coli)、沙门氏菌自然产生的OMVs的抗肿瘤作用。结果表明，OMVs在荷瘤小鼠体内具有显著的诱导抗肿瘤免疫反应和治愈肿瘤的能力，且没有引发明显的不良反应。OMVs在IFN-γ缺陷荷瘤小鼠中产生没有类似的效果，证明这种抗肿瘤效应是IFN-γ依赖性的[9]。

1.3 OMVs将抗肿瘤药物靶向传送到肿瘤组织

为了能进一步产生更显著的抗肿瘤效应，多项研究利用OMVs的生理形态特点对OMVs进行改造，使OMVs成为抗肿瘤药物传递的载体，将其直接运送到肿瘤内部发挥抗肿瘤效应，包括替加氟[10]、多柔比星[11]、紫杉醇和小抑制RNA[12]等。也有研究致力于增强OMVs的肿瘤靶向性从而相应地减少OMVs在肿瘤以外其他健康组织的非特异性积累[4]。

1.4 OMVs表达异源蛋白

癌细胞在突变过程中会发生基因改变而导致蛋白表达异常，结果就是产生正常体细胞没有的新抗原表位，新抗原特异性T细胞反应性是癌症免疫治疗成功的主要活性成分[13]。携带肿瘤抗原的OMVs进入动物机体后会诱导机体产生特异性免疫应答，从而起到治疗和预防肿瘤的效果[14]。

2 细菌外膜囊泡的加工方法

2.1 基因工程修饰

通过质粒转化可使大肠埃希氏菌表达的异源外膜和周质蛋白可以装载到其分泌的OMVs上。编码Ail(小肠结肠炎耶尔森氏菌的外膜黏附素/侵抗素)的质粒被导入大肠埃希氏菌DH5、HB101和MC4100菌株中后，从来自这些菌株的纯化OMVs和外膜中均检测到了Ail。携带Ail的OMVs的黏附和内化特性会发生改变。在Tat-GFP(双精氨酸转运蛋白-绿色荧光蛋白)转化的大肠埃希氏菌菌株的OMVs中检测到链霉蛋白酶抗性荧光，表明GFP存在于完整的OMVs中。后来有研究也通过质粒转化的方法使不同的细菌OMVs携带各种异源蛋白[15]。控制异源蛋白抗原的过度表达，有助于增加诱导的免疫反应的广度和幅度，从而增强对同一细菌物种的不同菌株或多个物种的保护作用[2]。

除了异源蛋白，将合成目的多糖所需的基因克隆到表达载体，然后再转化到特定菌株中，也可使OMVs装载异源多糖。有研究展示了糖工程OMVs作为小鼠肺炎链球菌(S.pneumoniae)和鸡空肠弯曲菌(C.jejuni)疫苗的有效性[16]。使用某些基因缺失的菌株来生产相应功能改变的OMVs也是研究人员对OMVs进行开发利用的常用手段，如msbB基因缺失的大肠埃希氏菌突变体产生的脂多糖比野生型脂多糖具有更少的酰基链，这会使细菌及其产生的囊泡的毒性降低[17]。

2.2 物理方法

除了用基因改造的方法使革兰氏阴性菌OMVs携带特定蛋白或多糖，还可以用物理方法将各类具有抗肿瘤效应的药物并入OMVs中，例如通过电穿孔将小干扰RNA导入OMV后，OMVs在肿瘤组织聚集并释放小干扰RNA以抑制肿瘤进展。也有研究人员用超声或挤压的方式将OMVs包裹在装载有药物的纳米颗粒上[10]。通过超声的方法还可以使OMVs与其他细胞的胞膜融合以达到增强特异性抗肿瘤免疫和提高其肿瘤靶向性的目的[18]。

2.3 其他

给细菌培养基里添加某种药物可获得含有这种药物的OMVs[19]。在大肠埃希氏菌(BL21)OMVs上覆盖一层磷酸钙(CaP)不仅可以克服OMVs在静脉注射时产生的抗体依赖性清除和高毒性障碍，还可以中和酸性肿瘤微环境，导致巨噬细胞由M2到M1的高度极化。此外，CaP层还有和叶酸和光敏剂吲哚菁绿结合的特性，这进一步提高了抗肿瘤效果[20]。

3 细菌外膜囊泡的抗肿瘤应用研究

3.1 基因工程改造OMVs的抗肿瘤应用研究

3.1.1 表达肿瘤抗原的OMVs 研究人员设计了一个基于OMVs的多功能疫苗平台，通过特异性地将抗原呈递到OMVs表面来诱导特异性的抗肿瘤免疫反应。首先通过与ClyA蛋白融合的方式在OMVs表面展示肿瘤抗原，结果表明由OMVs表面的ClyA蛋白展示的抗原肽成功的激活了小鼠肿瘤模型的机体免疫反应，促进了树突状细胞的成熟及其对相应抗原的递呈，抑制了表达相应抗原的黑色素瘤的肺转移现象。然后再通过使用由标签/捕捉蛋白对组成的即插即用显示系统简化抗原显示过程。用不同的蛋白质捕捉器修饰的OMV可以同时显示多种不同的肿瘤抗原，从而引发协同抗肿瘤免疫反应[14]。高危基因型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染会引发宫颈癌的发生。研究人员通过基因重组技术将人类乳头瘤病毒16型早期蛋白基因嵌入到工程OMVs中，成功诱导HPV-16癌蛋白E6、E7和c-Ha-ras癌基因共转化TC-1移植瘤荷瘤小鼠的特异性细胞免疫反应并抑制肿瘤生长[21]。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，BFGF)是除血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)外的另一种重要的血管生成分子。VEGF信号被抑制后，BFGF水平会代偿性升高，从而再次促进血管生成，导致抗VEGF治疗的耐药性。有研究人员开发了一种以OMVs为载体的抗肿瘤治疗纳米疫苗。用基因重组技术将154个氨基酸组成的BFGF装载到大肠埃希菌OMVs上。利用OMVs的强佐剂作用诱导宿主产生抗BFGF自身抗体，并凭借OMVs的特性打破B细胞自身耐受。小鼠经3次免疫后可产生持久的抗BFGF自身抗体来对抗BFGF的功能，其作用包括多种肿瘤抑制功能，比如抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤免疫屏障和促进肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTLs)，最终导致肿瘤消退[22]。用稳定表达人表皮生长因子受体变异Ⅲ 型变异基因的B16F10黑色素瘤细胞系上的两个保护性表位来修饰OMVs，最终得到的工程OMVs免疫小鼠后可诱导高滴度的抗人表皮生长因子受体变异Ⅲ 型抗体，抑制了黑色素瘤细胞系在小鼠的成瘤性[23]。

3.1.2 携带肿瘤表面受体配体的OMVs 肿瘤细胞在持续暴露于IFN-γ后其表面表达程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)是肿瘤的一个免疫逃逸机制。PD-L1与T细胞表面的程序性死亡1(programmed death 1，PD1)结合后会诱导T细胞功能障碍和凋亡从而抑制炎症反应，保护肿瘤细胞免受免疫系统的监视。有研究报道了通过插入PD1外结构域修饰表面的基因工程OMVs抗肿瘤的作用。OMV-PD1可以结合肿瘤细胞表面的PD-L1，促进其内化和减少，从而保护T细胞免受PD-L1 /PD-L1免疫抑制轴的影响。通过免疫激活和检查点抑制的联合作用，工程OMVs驱动效应T细胞在肿瘤中积累，进而导致对肿瘤生长的强烈抑制[24]。

人类表皮生长因子受体2是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，在细胞生长调节、存活和分化中发挥重要作用。在18%～25%的乳腺癌、卵巢癌、胃癌和唾液腺肿瘤中过表达，因此，这是癌症诊断和治疗的一个有吸引力的目标。有研究将细菌分泌的OMVs经过生物工程降低其内毒素，并表达靶向人类表皮生长因子受体2的高效亲和配体，这进一步增强了OMVs对肿瘤的靶向性。有研究人员将可编码肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的质粒导入大肠埃希氏菌中，当含有TRAIL的大肠埃希氏菌衍生的OMVs应用于皮肤黑色素瘤部位时，OMVs可以靶向黑色素瘤体，最终通过释放TRAIL活性分子来启动肿瘤治疗效果[4]。

3.2 载药OMVs的抗肿瘤应用研究

有研究人员[10]提出了一种生物工程方法，将减毒鼠伤寒沙门氏菌OMVs包裹在装载有癌症化疗药物替加氟的聚合物胶束上，还以聚乙二醇和肿瘤靶向配体修饰OMVs表明以增加OMVs的稳定性和肿瘤靶向性。这样设计的工程OMVs可发挥化疗和免疫调节双重作用，使肿瘤细胞对CTLs敏感，并直接杀伤肿瘤细胞。全身注射这种OMVs，不仅能对黑色素瘤的发生提供有效的保护性免疫，而且能显着抑制体内肿瘤的生长，延长黑色素瘤小鼠的存活率，还可以有效地抑制肿瘤向肺部的转移。

研究表明，OMVs是肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)重编程的强大免疫刺激剂。而通过仿生矿化将CaP覆盖在大肠埃希氏菌(BL21)OMVs上可以克服OMVs在静脉注射时产生的抗体依赖性清除和高毒性障碍。CaP对pH敏感的特点有助于酸性TME的中和，导致巨噬细胞由M2到M1的高度极化，从而提高抗肿瘤效果。此外，将叶酸掺杂到CaP中可以促进组装OMV对肿瘤的主动靶向。还用光敏剂吲哚菁绿对组装OMV进行功能化，以促进光热诱导的免疫原性细胞死亡。被CaP包裹的OMVs也能够有效地被动积聚在肿瘤区域，即使重复注射也是如此。用来覆盖OMVs的CaP大大降低了OMVs的毒性，即使采取高剂量静脉注射的方式将组装OMVs输送到实验小鼠体内也没有出现突发致死现象[20]。

有研究人员[12]将OMVs用于同时装载紫杉醇和调控发育和DNA损伤反应1 (Redd1)-siRNA，以调控肿瘤代谢微环境，抑制肿瘤生长。在肿瘤微环境的pH6.8情况下，OMVs中的紫杉醇的释放首先会被触发，然后Redd1-siRNA被M2巨噬细胞吸收，增加M2型巨噬细胞糖酵解水平，将巨噬细胞的代谢表型从促进肿瘤进展的表型调控到抑制肿瘤进展的表型。在三阴性乳腺癌模型中，此OMVs对肿瘤相关巨噬细胞复极化、肿瘤抑制、肿瘤免疫激活和TME重塑具有巨大潜力。研究表明[25]，将OMVs与黑色素瘤细胞膜通过超声的方式融合形成对黑色素瘤有特殊靶向作用的杂交仿生膜，再将其包裹于聚多巴胺纳米颗粒。这样的杂交膜进入实验小鼠机体后会激活抗肿瘤免疫反应并造成部分肿瘤细胞的死亡，而后靶向并聚集在肿瘤位点，与肿瘤细胞接触后被其内化，此时多巴胺发挥光热治疗作用进一步产生肿瘤杀灭效果。抗肿瘤药物多柔比星通过OMVs运输用于治疗肿瘤降低了其在实验小鼠机体引起的副作用[11]。

4 OMVs用于兽医临床肿瘤治疗的展望

细菌疗法已经出现多年了，从早期的直接应用野生型细菌，凭借细菌天然的对肿瘤环境的靶向与定植效应与肿瘤细胞接触，到后来将细菌进行工程改造，降低其毒性，提高其对肿瘤的靶向性及杀伤能力。细菌的抗肿瘤研究取得了一定成果，但因其安全性和有效性问题，还仍未达到临床转化的水平。而OMVs来源于细菌，携带大量来自细菌的抗原及毒性分子，所以不可避免地需要考虑和细菌一样减毒或去毒的问题，但是OMVs没有活性，所以它的应用比细菌更容易把控。而同样是进行基因改造，OMVs被细菌产出后不存在突变的情况，这使得OMVs的安全性有了可控的保障。此外，对于药物的装载，OMVs拥有比细菌小的多的体积，易于将药物由血液循环带到特定的治疗位点，且有载药效率高的特点。

肿瘤性疾病在兽医临床是一类高发疾病，虽然一部分病例能够通过常规的手术、化疗或放疗治愈或控制，但仍有很多问题亟待解决。比如IL-2获得美国食品药品管理局许可用于转移性肾细胞癌和黑色素瘤的免疫治疗，且证明对犬肿瘤有治疗效果[26]。但是直接注射IL-2对机体存在严重毒性，比如可导致毛细血管渗漏综合征。运用生物载体将IL-2输送到肿瘤组织是保留其肿瘤疗效和避免其毒性的一个有效的方法。但是将表达IL-2的细菌直接进行静脉注射有产生严重不良反应的风险，如血小板减少、贫血、持续性菌血症等，虽然口服可以避免这种风险，但似乎也会失去细菌原有的抗肿瘤效应。而OMVs具有类似细菌的抗肿瘤作用，且产生毒性的风险低于细菌，更合适作为向机体递送药物的生物载体。此外，OMVs经培养细菌就可获得，经济成本较低，若成功开发出成熟的基于OMVs的抗肿瘤制剂，即可以批量生产，减轻临床上治疗肿瘤的费用昂贵的压力，用于宠物行业以及野生动物，提高动物福利。虽然细菌外膜囊泡用于兽医临床的应用研究还未见报道，但笔者认为这项研究的意义是深远的，可能会为动物肿瘤性疾病的治疗提供理论依据和支持，也可能为人类肿瘤研究提供重要的动物模型参考，这将具有重要的比较医学和临床转化的意义。

5 结语

综上所述，与传统肿瘤治疗方法相比，基于OMVs的疗法有着它独特的优势，可以避免细菌疗法所产生的临床应用问题。而且OMVs可以随着细菌的大量繁殖即得到极高的产量，可实现大量提取，所以非常有利于研究人员对其的研究与开发。相信在未来，凭借生物工程技术的发展及研究人员的深入探索，OMVs有望成为理想的抗肿瘤免疫反应激活剂和肿瘤治疗药物传递平台，为人类和动物临床上的肿瘤治疗提供经济有效的手段。