噬菌体在畜牧养殖及肉制品加工中的应用

孙新城，许素月，李侠颖，赵成鑫,，胡旭阳，胡金强高 辉,2,3，杨德良，白艳红,2,3*，张晓根

(1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450001；2.河南省冷链食品质量安全与控制重点实验室，河南郑州 450001；3.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南郑州 450001；4.长安大学经济与管理学院，陕西西安710064)

随着人们生活水平的提高，对于动物蛋白的需求量也越来越大，使得畜牧行业开始向产业化大规模转型，发展过程中细菌性疾病的防治成了必须要解决的问题[1]。抗菌药物是化学合成的一种抗菌类药物，在畜牧生产过程中对于细菌性疾病具有较好的预防和治疗效果。然而抗菌药物在畜牧养殖业持续性且大批量的使用也逐渐的产生了很多问题，例如细菌的耐药性、肠道菌群破坏和抗菌药物残留等问题，对养殖行业造成一定损失的同时，也严重威胁了人类的身体健康[2]。由于逐年累积的使用抗菌药物，部分细菌产生了变异，原来的抗菌药物不能再继续发挥抑制细菌的作用，养殖业在面对新的变异细菌时不得不承受严重损失[3]。在动物生长的过程中如果添加抗菌药物实现抗病力提高或促进发育等目的，会极大的扰乱动物本身的免疫调节能力，停止抗菌药物的使用会对动物的生长造成严重影响，并且对于后代繁衍以及养殖环境中的菌群平衡都有一定的影响[4]。通常情况下抗菌药物在动物体内需要一定的时间才能够完全代谢，如果时间不够会使得抗菌药物在肉类等农产品中残留，最终人类在食用之后对身体健康也会产生影响，抗菌药物残留是人们关注的食品安全健康问题之一。

在抗菌药物滥用问题的背景下，噬菌体作为一种特异且安全的抑菌剂开始被研发人员所关注。噬菌体自身的基因组较小，但是在宿主菌中却能产生较大的影响[5]。较小的基因组会使得研究应用的时间大大缩短，操作过程更加简易，研发成本也会相应降低。噬菌体本身来自于自然界，只是对特定的菌群产生反应，对原本的生态菌群不会产生不利影响，是一种环境友好型的生物抗菌剂，十分迎合当代人提倡的绿色无公害要求。另外，噬菌体会随着细菌的突变自身也发生进化，是一个自发且符合生态环境要求的过程，不会产生耐药性等问题[6]。噬菌体超强的特异性肯定了其安全性，不会在肉、蛋、奶等畜牧产品中残留，即使人体食用，对肠道内原本的益生菌也无侵染效果，所以噬菌体在畜牧养殖行业中应用具有较大价值。

1 噬菌体概述

随着生物技术的不断发展，对噬菌体的认识越来越深入，有人把能够侵袭真菌、藻类、细菌以及放线菌等微生物的病毒都称为噬菌体。噬菌体广泛存在于自然界的各种环境中，几乎有细菌群落的地方就有噬菌体的存在，有数据估计地球上有1031个噬菌体[7]。噬菌体种类多种多样，并且特异性极高，对于某一种或一类微生物有效，但是对于非目标靶向的其他细菌或者人类是无毒且具有极高的安全性。噬菌体的分类方法也是多种多样的，根据噬菌体侵染宿主时的表现分为伪溶原性、溶原性、裂解性和慢性感染4种类型[8]。噬菌体的核酸主要有DNA和RNA两种，根据核酸的类型又可以分为单链RNA(ssRNA)、单链DNA(ssDNA)、双链RNA(dsRNA)和双链DNA(dsDNA)4种类型。另外，国际病毒命名委员会(ICNV)对噬菌体进行了更加细致的分类，在15个科中大多数都是有尾噬菌体，根据尾部的结构更深一步进行了区分，其中短尾噬菌体占14%，长尾噬菌体科占61%，肌尾噬菌体科占25%[9]。噬菌体的种类多种多样并且长度变化很大，目前发现的最短噬菌体24 nm，最长的噬菌体200 nm，T4噬菌体是目前已知的最大的噬菌体。噬菌体的组成较为简单，几乎都是由蛋白质外壳和遗传物质核酸组成[10]。噬菌体的增殖包括吸附、侵入、生物合成、装配和释放五个阶段，整个过程完全依赖宿主提供必需的物质[11]。吸附是噬菌体侵染宿主的第一步，主要依靠蛋白外壳与宿主细胞外部蛋白特异性结合来实现，一旦特异性蛋白损坏宿主菌就具有了抵抗噬菌体的能力。侵入是通过噬菌体尾部释放特定的溶菌酶将宿主菌的外膜破坏，然后噬菌体将遗传物质核酸注入到宿主菌的过程。生物合成是进入到宿主菌的核酸通过宿主体内的各种物质合成自身的mRNA，然后进一步合成早期的蛋白质[12]。等噬菌体的各部件合成后就会进行下一步装配，将各种蛋白质按照一定程序组装在一起，大体分为4个阶段：头部装配、尾部装配、头部与尾部装配、长尾丝装配[13]。最终组装好的噬菌体通过释放内溶素等物质将宿主菌的细胞膜裂解，从而将子代噬菌体释放出来。

2 噬菌体在畜禽幼龄期的应用

幼龄培育是养殖行业中的重要环节，然而环境中的感染性细菌无处不在，主要的细菌为大肠埃希氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌。一旦感染了细菌性疾病很容易造成幼龄期的动物大量死亡，对养殖场造成较大损失。目前，研发人员已经分别从养殖过程的各种环境中分离出多种多样的噬菌体，采用不同的防治方法去对抗细菌性疾病，且在不同动物的应用过程中取得了较好的效果。

雏鸡由于本身免疫系统不够完全很容易被感染，感染后容易造成生长迟缓，严重的会引起大量死亡，研发人员尝试使用单一噬菌体或者混合噬菌体的方式对其进行防治。刘功成[14]曾在1日龄的三黄鸡日粮中添加了噬菌体，结果表明单一噬菌体能够有效提升雏鸡的成活率。Kim J H等[15]也是从1日龄的肉仔鸡开始投喂含有混合噬菌体的饲料，饲养35 d后发现投喂了混合噬菌体的肉仔鸡发育更好，并且有效抑制了致病菌的感染。曹忠赞等[16]使用噬菌体制剂对感染了沙门氏菌的雏鸡进行治疗，结果表明在雏鸡的肝和盲肠中致病菌的数量显著减少，最终雏鸡的肝和盲肠都恢复到了正常水平，由此可知在防治雏鸡感染沙门氏菌时噬菌体有良好的抑菌效果。Kaikabo A A等[17]也曾采用壳聚糖包被噬菌体的方式对幼龄鸡进行治疗，使得幼鸡的死亡率降低了40%，并且发现壳聚糖包被使用噬菌体的方法能够有效提升噬菌体在幼鸡体内的存活率。

在仔猪培育的初期，如果受到致病细菌的感染，会导致腹泻、生长受阻以及成活率降低等众多不良现象，目前研究者已经试验了多种噬菌体疗法，并取得了较好成果。曾永娣等[18]曾经尝试给断奶的仔猪饲料中添加噬菌体，并使用添加抗菌药物的饲料作为对照，最后发现饲料中添加噬菌体的仔猪增重更多，并且腹泻率大大降低，相比于添加抗菌药物，噬菌体能够有效提升仔猪肠道中益生菌的活性。Seo B J等[19]的研究表明，当给28日龄的仔猪饲料中添加噬菌体鸡尾酒后，仔猪受沙门氏菌感染的风险降低，并且仔猪本身的肠道益生菌活性并未受到影响。Cha S B等[20]给断奶的仔猪投喂含有1 g/kg噬菌体的饲料，持续投喂1周后再用肠毒性大肠埃希氏菌进行攻击，最终发现投喂噬菌体的仔猪抵抗力有效加强，被肠毒性大肠埃希氏菌感染的几率下降了约60%。

3 噬菌体在畜禽成长过程中的应用

在畜禽的成长过程中如果被致病菌感染，对于动物的后期发育以及后期繁殖都会造成很大的影响，极大的提升了养殖成本。研究人员从动物的生存环境中筛选出具有特异性治疗的有益噬菌体，致力于解决各种致病菌的生物防治。

猪在生长过程被致病菌感染会对肠道菌群影响很大，对于饲料中的营养物质难以吸收，产肉率会大大降低。Yan L等[21]曾在猪的生长过程中持续饲喂了6周的噬菌体，最终检测发现猪粪便中沙门氏菌的含量下降很多，并且对于饲料中的干物质和氮源的吸收效果增强。另外Saez A C等[22]采用了微囊包裹噬菌体鸡尾酒的方法放在饲料中对生长猪进行投喂，并且与灌喂的方法进行了对比，数据显示微囊包裹的方法效果更好，噬菌体鸡尾酒有效的降低了生长猪肠道中的沙门氏菌数量。

对于牛和羊等产奶类动物，在养殖过程中极易被金黄色葡萄球菌等致病菌感染导致乳腺炎的发生，抗菌药物并不能治疗被生物膜包裹的致病菌，噬菌体却能够穿过生物膜并可以专一性的治疗，是较为理想的治疗方法。在奶山羊生长发育的过程中金黄色葡萄球菌会引起乳腺炎，Mishra A K等[23]曾经分离出溶菌性噬菌体对奶山羊中的耐药性金黄色葡萄球菌进行了治疗，结果表明在30 ℃和40 ℃时噬菌体稳定并且裂解效果极好。冀亚路等[24]从污水中分离出一种裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体，该噬菌体具有较强的杀菌能力，并且具有较宽的宿主谱(64%)，可以用于治疗患有乳腺炎的奶牛。Varla-Oritz D F等[25]从患有隐形乳房炎症的奶牛牛乳中筛选出裂解性噬菌体，数据显示牛乳中的36株金黄色葡萄球菌种大多数都对抗菌药物具有耐药性，而经噬菌体裂解后被杀死的几率是百分百。

4 噬菌体在肉制品加工中的应用

人们生活品质的不断提升，对肉、蛋、奶等食品的需求量越来越大，在大规模生产这些食品的同时预防食源性致病菌的问题也日益严重，近年来报道的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、李斯特菌等致病菌污染的事件造成巨大经济损失，同时对食用者的安全也存在威胁[26]。研究人员尝试着从养殖过程，肉制品生产过程、保藏运输和销售等不同时期利用噬菌体进行生物防治，取得了较为理想的效果。

牛肉因为其高蛋白低脂肪的特点被人们广泛食用，然而被沙门氏菌等致病菌污染的牛肉被食用后，会将感染食用人群，因此预防牛肉感染成为了必须要解决的食品安全问题。David等曾尝试用噬菌体鸡尾酒达到给牛肉灭菌的效果，结果显示噬菌体鸡尾酒的效果优于单一噬菌体，并且在4 ℃的环境中储存6 d后仍然有很好的灭菌效果[27]。聂若男等[28]筛选出一株裂解性噬菌体，将该噬菌体用于牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的防治，在4 ℃和25 ℃两种条件下进行了抑菌测试，在两种温度下牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的感染率均降低，表明筛选的噬菌体对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌具有良好的抑菌效果。

中国作为一个肉制品消费大国，除了牛肉外对于其他生鲜类的肉制品也是需求量巨大。在生鲜肉的抑菌防治过程中，生鲜肉与噬菌体的接触面积对于抑菌效果的影响较大，接触面积越小效果越理想。Sharma C S等[29]使用切碎的火鸡肉和整块的火鸡肉做了对比试验，结果发现整块火鸡肉的噬菌体抑菌效果要明显优于切碎的火鸡肉，分析原因是切碎后表面积增大使得细菌与噬菌体的接触几率降低。但是Yeh Y等的试验结果也证明了噬菌体对于碎肉有抑菌效果，他们将碎肉与噬菌体和致病菌混合揉滚2 h后放于4 ℃的环境中冷藏，数据表明显著抑菌的时间可持续6 h[30]。另外，在一些即食食品中噬菌体同样有较好的杀菌效果。Chang Y等[31]曾使用噬菌体产生的内溶素用于火腿样品，数据显示在15 min内的抑菌效果较好。

在我国蛋制品也是餐桌上不可缺少的元素，然而如果鸡、鸭、鹅等动物在养殖过程被致病菌感染，很可能会对蛋的产量以及蛋的品质有所影响。研究人员曾经筛选出一株裂解能力强并且噬菌谱较广的噬菌体，经试验证明对于蛋黄和蛋白中感染的多重耐药沙门氏菌具有较好的抑制效果[32]。如果鸭在养殖过程中受到沙门氏菌的感染，在鸭肉被感染的同时产出的鸭蛋也会受到污染，会给养鸭业造成巨大的损失。有学者曾经从鸭场中分离出1株噬菌谱较广的噬菌体，试验表明该噬菌体在3 h可以保持较强的噬菌体裂解能力[33]。

5 展望

在对畜牧养殖行业生态环保且安全可靠的高标准要求下，噬菌体治疗不产生耐药性、特异性强、来源广泛、绿色环保、研发容易等等优势会越来越显著，相信在研究人员的共同努力下，噬菌体制剂会不断研发用于各种致病菌的生物防治。但是噬菌体制剂研发过程也需要解决一些问题，首先用于噬菌体制剂研发的噬菌体要有较好的稳定，不会产生毒素等其他不良物质；其次噬菌体制剂使用的噬菌体最好具有较广的噬菌谱，能够同时抑制多种致病菌；再者噬菌体的给药方式要不断优化，对于某些致病菌来说口服噬菌体的给药方式并不是特别合适；最后噬菌体的给药剂量也需要不断探索。相信在科学技术飞快发展以及研究水平不断提高的背景下，噬菌体目前面临的问题都会被解决，在不久的将来，噬菌体能够成为一种绿色、安全且高效的生物防治试剂，噬菌体制剂的应用必将对畜牧养殖行业产生正向且积极的影响，对人类的健康也意义深远。