蚯蚓抗菌肽研究进展

马占飞，李 杨，王亚博，姜国均

(河北农业大学动物医学院,河北保定 071000)

蚯蚓(earthworm;)俗称地龙、曲蟮，目前世界上的蚯蚓超过了3 000种，中国有记录的蚯蚓达到了9科28属306种(含亚种)。蚯蚓栖息在土壤之中，经常暴露在含有多种微生物及病原体的环境中，并不断受到污染物的侵扰，蚯蚓之所以在恶劣的环境中可以生活良好，得益于它自身强大的免疫系统，包括细胞免疫系统、体液免疫系统和蚯蚓抗菌肽[1]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)最早被发现于20世纪80年代，瑞典科学家Boman用细菌刺激天蚕(Hyalophoracecropia)后，首次发现了AMPs-天蚕素(cecropins)。AMPs抗菌谱广，毒副作用小，对环境几乎没有危害，是替代抗生素比较理想的药物。本文对国内外文献进行整理分析，对蚯蚓AMPs的分类、作用机理和应用进行综述，为蚯蚓附加值产品的开发和产业化提供理论依据。

1 蚯蚓抗菌肽的分类

1.1 富含脯氨酸的抗菌肽

动物机体在免疫刺激下会产生各种AMPs，其中一类AMPs的脯氨酸含量较高，我们通常把这类AMPs称为富含脯氨酸的抗菌肽(proline-rich antimicrobial peptides，PrAMPs)[2]。PrAMPs广泛存在于各种昆虫以及哺乳动物体内，脯氨酸的大量存在会影响AMPs的结构、功能以及抗菌作用。例如，Cho J H等[3]从蚯蚓(Lumbricusrubellus)中分离表征的Lumbricin Ⅰ。Lumbricin Ⅰ的脯氨酸占比为15%，高含量的脯氨酸造成了Lumbricin Ⅰ肽链的侧链环化回到主链酰胺位置，这是脯氨酸赋予肽链独特的结构。此外，Li W L等[4]从蚯蚓(Pheretimaguillelmi)皮肤分泌物中分离出一种新的类蚓蛋白酶AMPs，命名为Lumbricin-PG，成熟的Lumbricin-PG含有59个氨基酸，脯氨酸含有9个(脯氨酸占比15%)，它与来自Lumbricusrubellus的Lumbricin Ⅰ具有66%的同源性。Wang X等[5]也从蚯蚓(Pheretimatschiliensis)的cDNA末端快速扩增，获得了一种假定AMPs(命名为PP-1)的cDNA，PP-1不仅含有高量的脯氨酸，且其与 Lumbricin Ⅰ和高度保守的N端部分有77.6%的氨基酸同源性。

经查阅文献进行总结后发现富含脯氨酸的蚯蚓AMPs，都为Lumbricin的同系物，并且这些AMPs并不都是来自同一种蚯蚓，这些AMPs的脯氨酸含量都在10%～15%之间。此外高含量的脯氨酸可能会对AMPs的表达产生影响，Bodó K等[6]研究发现了2种富含脯氨酸的蚯蚓AMPs，命名为Lumbr和LuRP，这2种AMPs与Lumbricin Ⅰ有较高的同源性，并且他们发现在蚯蚓个体发育过程中，Lumbr与LuRP的的表达在胚胎中持续增加，这与Cho J H等[3]发现的结论类似。所以富含脯氨酸的AMPs的表达可能会随着个体的成熟与否来变化。

1.2 富含芳香族氨基酸的抗菌肽

大多数AMPs携带阳离子，也有一小部分呈中性。而细菌膜上的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)成负电性，AMPs通过与细菌膜上的LPS相结合，破坏膜结构的完整性，从而达到抑菌的效果。Azuma E等[7]研究发现，通过同时引入正电荷(+9～+10)的芳香族氨基酸残基可提高典型AMPs F5W-magainin 2的治疗指数，加入正电荷+9的芳香族氨基酸残基后能够增强F5W-magainin 2的抗菌活性，这可能是由于芳香族氨基酸携带阳离子，而富含芳香族氨基酸的AMPs与细菌膜上LPS的结合能力也因为芳香族氨基酸的原因大大提高，最终使得AMPs广谱抗菌活性大大提高。加入正电荷+10的芳香族氨基酸残基后可以降低F5W-magainin 2的细胞毒性。Ghosh S[8]经研究也发现了带正电荷的氨基酸在维持AMPs结构功能稳定性方面发挥作用。总之，正电荷数量的增加为AMPs带来了正向收益。

Milochau A等[9]在蚯蚓(Eiseniafetidaandrei)体腔液中分离出来表观分子质量分别为40 ku与45 ku的两种蛋白，命名为Fetidins，它们不仅具有溶血，凝血的功能，而且还具有光谱的抗菌活性，它们均可抑制巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、以及螺旋体(Spirochete)的生长。Dhainaut A等[10]用大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)接种蚯蚓(Nereisdiversicolorterrestris)，采取蚯蚓体腔液后采用凝胶过滤和离子交换色谱两种方法纯化后，得到分子质量为10 ku的抗菌蛋白MP(Ⅱ)，该蛋白由2个相同的亚基组成，富含芳香族氨基酸，半胱氨酸含量较低。存在于蚯蚓体腔的G1粒细胞内，未免疫的蚯蚓体内的抗菌活性非常低，但是大肠埃希氏菌与铜绿假单胞菌可以激发钙蛋白的抗菌活性，其于镉蛋白有高度的相似性。

1.3 其他蚯蚓抗菌肽

另外，还有一些被分离出来具有广谱抗菌活性的AMPs。孙振钧等[11]经过硫酸铵沉淀、超滤和阳离子分离，在蚯蚓(Eiseniafotida)体内分离出一种分子质量约为20 ku的抗菌蛋白EABP-1，EABP-1具有广谱的抗菌活性，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。他们在分离EABP-1的步骤上增加了快速反应液相色谱(FPLC)分析法，在Eiseniafotida体内分离纯化出2种分子质量分别为0.535 ku与0.519 ku的AMPs，命名为F-1和F-2，它们对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌都有一定的抑制作用[12]。

王庄等[13]通过电击蚯蚓，然后采用超滤浓缩脱盐、阳离子交换分离以及凝胶过滤层析方法，纯化得到3 ku～30 ku的AMPs，分别有H1、H3两个蛋白浓度较高的峰值，其分子质量分别在5.856 ku～7.823 ku和14.40 ku～20.00 ku。其中H1对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌(Pasteurella)、大肠埃希氏菌有明显的抑菌效果,H2对巴氏杆菌(Pasteurella)、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌也有明显的抑菌效果,H1的抑菌活性比H2高。

这些分离纯化出来的蚯蚓AMPs还需要进行更深入的研究，例如它们的二级结构、抑菌机制以及使用剂量等问题需要进一步解决。

2 抗菌肽的作用机制

AMPs具有广泛的抗菌活性，它的作用机制大体上可以分为在细胞膜发挥作用与在细胞膜内发挥作用两种，其中作用于细胞膜的机制包括桶状模型、环孔模型、地毯模型和类似洗涤剂的模型[14]；作用于细胞内的机制包括抗菌肽抑制DNA的合成，抑制蛋白质的合成[15]、抑制细胞壁的形成[16]、抑制酶活性[17]、影响细胞分裂[17]等。此外，还会有一些特殊的作用机制，不同AMPs的作用机制并不相同。

2.1 在细胞膜发挥作用

目前，人们对α-螺旋肽的研究比较深入，此类结构的AMPs发挥作用大多都是通过与膜上的LPS相结合或者竞争与LPS结合的二价阳离子(Ca2+/Mg2+)，改变或者是破坏膜结构，导致膜的完整性发生变化。在桶状模型中，肽分子疏水区与磷脂分子结合朝向膜内，亲水区朝向膜外形成桶状管道[18]。在环形孔虫洞模型中，AMPs疏水区与磷脂分子结合后，诱导膜向内弯曲形成孔[18]，最后，在地毯模型中，AMPs大量分布在膜表面上，形成地毯样，肽分子的疏水区与膜上的磷脂分子结合，亲水区朝向外部，大量的肽分子分布在膜表面，当肽分子的数量达到一定程度，就会使膜遭到破坏[18]。最后，AMPs会聚集在膜的表面，当增加到一定浓度之后，AMPs就会像洗涤剂一样，将膜分解成小块[20]。例如来自于天蚕蛹中分离的天蚕素，在高浓度时，天蚕素会采用类似地毯和类似洗涤剂模型，分裂掉细菌细胞膜。

2.2 在细胞内发挥作用

关于AMPs对细菌的作用机制，主要集中在AMPs对细菌细胞膜的作用，但是，随着人们对AMPs的深入研究后发现，AMPs对细菌的作用不仅仅局限在细胞膜，它们也会进入细胞内发挥作用[20]。AMPs进入细胞后，抑制细菌DNA、蛋白质合成，破坏蛋白质的结构功能，或者影响酶的活性，使得细胞代谢紊乱，导致细胞死亡。PrAMPs是一类特殊的阳离子AMPs，具有穿透细菌细胞膜、杀死细胞而不引起膜透性的能力[21]。Ho Y H等使用大肠埃希氏菌蛋白质组微阵列系统地鉴定了3种细胞内靶向AMP的蛋白质靶标：细菌素7(Bac7)，pleurocidin和dermaseptin(P-Der)的杂交体，乳铁蛋白B(LfcinB)，以及富含脯氨酸的精氨酸肽(PR-39)，研究发现，Bac7靶向嘌呤代谢和组氨酸激酶，LfcinB攻击转录相关活性和几种细胞碳水化合物的生物合成过程，P-Der影响小分子的几种分解代谢过程，PR-39优先识别参与RNA和叶酸的蛋白质代谢相关的细胞过程。此外，Bac7和LfcinB均靶向嘌呤代谢，而LfcinB和PR-39均靶向脂多糖生物合成[22]。

因为AMPs的作用机制受到氨基酸序列、带电量、两亲性、物质结构的影响[23]，这也说明AMPs对细菌的作用机制是多种多样的，不同的AMPs对细菌的作用也是不尽相同的。

2.3 其他作用机制

AMPs除了通过细胞膜或者是进入细胞内达到灭菌的效果，都是AMPs自身发挥作用。AMPs也可以通过调控免疫通路，激活免疫系统的运行，从而也可以达到杀灭细菌的作用。酚氧化酶原(Pro-po)激活系统就是无脊椎动物典型的自身免疫通路。对细菌抗原的识别后，蛋白酶开始水解无活性的Pro-po，进而切割成有活性的酚氧化酶(PO)，PO催化单酚的O-羟基化(O-hydroxylation)以及双酚氧化为醌，随后非酶聚合为黑色素，黑色素及其前体具有细胞毒性和抗菌特性，参与吞噬作用/调理作用、包裹/结节形成、脱颗粒和伤口愈合多种机体活动。例如在蚯蚓体内发挥积极免疫作用的CCF-1，有报道指出CCF-1有类似于人TNF-α的溶解作用，在溶血、细菌和肿瘤溶解中发挥作用，最重要的是CCF-1会通过识别酵母和革兰氏阴性菌的细胞壁成分参与Pro-po系统的激活[24]。

3 蚯蚓抗菌肽的应用

抗生素的滥用引起抗生素的耐药性，导致多种耐药菌的出现，对人类、动物以及环境造成巨大的危害，特别是多种耐药菌的出现，使得寻找新的替抗产品势在必行。AMPs作为一种来自于生物的蛋白材料，由于其独特的非特异性膜破裂机制，已经被发展称为强有力的候选分子[25]。而蚯蚓作为自然界丰富存在的生物，简单易得，所以大力发展蚯蚓的AMPs具有很广阔的前景。

3.1 在蔬菜种植中的应用

蚯蚓体内含有多种抗菌的活性成分，其中AMPs作为一类具有广谱高效灭菌的多肽分子，在蚯蚓的免疫防御中占有不可取代的地位。王东升等[26]研究蚓酶多肽对黄瓜的影响，发现使用蚓酶多肽的黄瓜不仅生长速度快，而且品质与营养价值也高于对照组，同时还使用蚓酶多肽使用在番茄上，发现番茄从抗病能力、产量和品质上都有所提高。

3.2 在养鸡生产中的应用

李娟等[27]研究蚯蚓提取物对伊莎雪佛黑鸡育成期生产性能及免疫功能的影响,发现在饮水中添加蚯蚓提取物对伊莎雪佛黑鸡血清补体C3、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、肿瘤坏死因子(TNF-α)均有显著影响,说明饮水中添加蚯蚓提取物可以增强鸡的体液免疫水平。

3.3 治疗小鼠帕金森等疾病

Kim D H等[28]在蚯蚓中分离的Lumbricin(NH2-RNRRWCIDQQA)在小鼠的神经干细胞中(MNSCs)显著提高细胞增殖(提高12%)，并通过蛋白酶体蛋白质降解而不是转录调节降低p27(Kip1)的蛋白质表达。而且Lumbricusin抑制了6-OHDA 诱导的MNSCs凋亡，并且还在小鼠帕金森病(PD)模型中显示出神经保护作用。因此，Lumbricusin可能被开发为治疗PD的潜在治疗剂。此外，Seo M等[29]基于Lumbricusin的氨基酸序列新合成了9聚体的Lumbricusin类似物，并通过使用BV-2小胶质细胞分析了其对LPS免疫反应的影响。发现其中一种Lumbricusin类似物Lumbricusin Analogue 5(LumA5)显著降低了由LPS和酶(COX-2、iNOS)、细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)和信号转导因子(AKT、MAPKs,NF-κB)在体外和体内引发的炎症反应。此外，LumA5 不仅减弱了SH-SY5Y细胞中小胶质细胞介导的神经毒性，而且减弱了LPS刺激的神经炎症小鼠模型中的炎症反应。

4 小结与展望

目前，抗生素所带来耐药性细菌的数量还在持续增加，受到自然界的启发，人们发现AMPs具有优于传统抗生素的独特优势[30]。AMPs作为比较理想的替代抗生素产品，具有广谱的抗菌活性，能提高炎症、肿瘤、病毒病等多种疾病的治疗效果，具有很广阔的应用前景。但AMPs广泛应用于临床还不太现实，主要原因是AMPs固有的局限性，包括其自身稳定性、对细胞毒性和生物利用度等原因[31]，并且AMPs的提取过程复杂、成本较高，现有技术还不能大规模的提取生产，所以深入地研究AMPs的分泌机制及其提取技术有十分重要的理论和现实意义。