棘球绦虫终末宿主粪样检测方法研究进展

李 敏，李 立，李文卉，贾万忠,2*，闫鸿斌*

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州 730046；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

棘球蚴(包虫)病是一种世界流行的危害严重的人兽共患病，对人群健康、畜牧业生产和社会经济发展带来较大影响[1]。在我国，包虫病广泛分布在青海、西藏、四川、新疆等西部地区。细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus,Eg)和多房棘球绦虫(E.multilocularis,Em)是棘球属中危害最严重的2种棘球绦虫，也是我国主要流行的2个种[2]。棘球绦虫成虫寄生于犬、狐和狼等犬科动物的小肠，成熟的孕卵节片会脱落，随着粪便排出体外后释放出虫卵，每个孕卵节片里一般有200个～800个虫卵，是引起人和动物棘球蚴病的传染源[3]。有些犬的肠道中会寄生成千上万条棘球绦虫，每条成虫都会通过有性生殖产生大量的虫卵，并不断地通过粪便排出体外。虫卵在外界环境中能够长期存活，对化学药物亦有较强的抵抗力，继而长期污染土壤、饲料、牧草和饮水[1]。随着我国城镇化和老龄化的发展，伴侣动物的饲养量持续上升，由此导致我国城市中每年出现大量流浪犬，流浪犬成为城市中包虫病传播的严重隐患[4]。因此，及时、准确检测终末宿主棘球绦虫感染情况，从而采取措施以减少和消除虫卵对环境的污染，对防控和净化棘球蚴病具有重要意义。目前，检测棘球绦虫的方法包括病原学检测、粪抗原和粪 DNA方法等。

1 病原学检测方法

传统的病原学检测主要是借助显微镜观察寄生虫形态等特征进行种属的鉴定。国际上普遍采用“氢溴酸槟榔碱泻下法”和“剖检法”检查犬科动物粪便样本。泻下法在现场检测中不易推广，一方面该方法具有高危险性，且耗时耗力，另一方面氢溴酸槟榔碱对犬科动物具有强烈的副作用，槟榔碱在大多数国家已不再用作犬的驱虫剂[5]。此外，该技术敏感性较低，用于诊断细粒棘球绦虫时敏感性仅为38%，诊断多房棘球绦虫时敏感性仅为21%[6-7]。剖检法阳性预期值可达到100%，是棘球绦虫感染检测的金标准。该方法能够对所有的肠蠕虫进行准确的定量分析，并确定它们的发育阶段。但是此方法适用于24 h内采集的新鲜样品，而且需要将犬处死，在实际工作中很难推广应用，只适合抽检和评价其他检测方法[8]。其他方法还包括肠黏膜刮取技术、容器振荡沉淀法、直接计数法等，以上方法虽然特异性高，但是棘球属种内及带科绦虫卵形态相似，无法鉴别，还存在感染操作者和污染环境的风险。随着技术的不断发展，这些方法已逐渐被取代。

2 粪抗原ELISA检测方法

2.1 常规ELISA

由于寄生于犬科动物小肠内的虫体，其代谢物、分泌物、脱落的节片或者虫卵等抗原随着粪便排出体外，粪抗原-ELISA检测法就是通过抗原-抗体的特异结合，对感染进行检测的方法[9]。该方法具有对被检动物无伤害、检测材料易获取、检出率高和操作者不易被感染的优点，感染动物驱虫治疗后仍能进行动态检测[4,10]。在过去使用较多的检测抗原包括成虫虫体抗原、原头节虫体抗原及其分泌物抗原、成虫表膜抗原等，但这些都属于棘球绦虫的粗抗原，获取这些检测抗原繁琐耗时，而以此研制成的试剂盒特异性和稳定性较差，易与犬肠道内其他常见寄生虫发生交叉反应，因此，特异性重组抗原筛选鉴定是研发犬粪抗原诊断方法的关键环节[5,11]。

细粒棘球绦虫抗原B(EgAgB8/3)在成虫阶段大量表达，而且属于虫体分泌抗原，随着感染犬的粪便排出而易于检测，试验证实EgAgB8/3可作为Eg感染犬粪抗原检测的理想靶分子[12]。陈洁等[6]通过制备抗EgAgB8/3重组蛋白的多克隆抗体，建立了双抗体夹心ELISA，其敏感性和特异性分别为85.0%和95.7%，但是会与犬复孔绦虫(Dipylidiumcaninum)发生交叉反应。张瑞妮等[13]为了克服交叉反应，应用具有融合标签自剪功能的表达载体PTWIN1对EgAgB8/3进行了表达纯化，为后续研究中EgAgB8/3的单克隆抗体的快速制备奠定了重要的基础。Morel N等[14]尝试针对成虫分泌物制备单克隆抗体，尽管所建立的ELISA总体非常好，但仍然会发生交叉反应。使用多克隆抗体作为捕获抗体(产生最大敏感性)、单克隆抗体作为检测抗体(产生最强特异性)可以提高粪抗原ELISA的敏感性和特异性，确保试剂盒的稳定性[5]。刘原源等[10]在细粒棘球绦虫中得到一个新的基因命名为EdiagA864，通过制备该蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体所建立的粪抗原双抗体夹心ELISA，特异性较强、敏感性较高、重复性较好，与犬贾第虫(Giardiacanis)和犬蛔虫(Toxocaracanis)样品均无交叉反应。使用表面糖蛋白/聚糖可能比用粗分泌抗原免疫制备单克隆或多克隆抗体更有效[5]。据文献报道，由于虫体表膜的分子组分不断更新，用以逃避宿主的免疫攻击，因此虫体表膜抗原是诊断抗原的研究热点。吐尔逊等[15]首次以成虫表膜蛋白作为标志物，建立的双抗体夹心ELISA法可检测到感染后13 d后的细粒棘球绦虫，该方法具有敏感性高和特异性强，不与多头带绦虫和泡状带绦虫发生交叉反应；并且该表膜抗原不属于阶段特异性抗原。Java L M等[16]基于抗细粒棘球绦虫可溶性膜抗原的多克隆抗体，开发出的ELISA的敏感性为96.1%、特异性为98.2%，与其他寄生虫无交叉反应，是迄今为止特异性和敏感性最高的试剂盒。吴小霞等[17]以多房棘球绦虫成虫可溶性抗原免疫新西兰兔得到的多克隆抗体作为检测抗体，单克隆抗体作为包被抗体研制的试剂盒，灵敏性较好，可在犬感染72 h～6 d后检测到多房棘球绦虫粪抗原。李双男[18]通过收集细粒棘球绦虫原头蚴感染犬后不同时间的犬粪，利用蛋白质组学、生物信息学等方法初步筛选了大量特异性诊断靶标分子，有待进一步验证，以期寻求更好的棘球绦虫粪抗原检测靶抗原。

2.2 斑点酶联免疫吸附试验

斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)是一种检测抗原或抗体的固相诊断方法，广泛用于人和动物感染性疾病的诊断[19]。Dot-ELISA和常规ELISA的反应原理基本一致，差别在于反应发生的固相载体不同。Dot-ELISA采用硝酸纤维素膜作为固相载体，ELISA采用聚丙乙烯板作为反应载体，因此Dot-ELISA除常规ELISA快速、特异的优点外，还有可常温保存、不需要仪器、可肉眼直接观察结果等特点，方便了操作者对阳性样品的判断，操作简单，加上良好的工作性能，极易推广到基层检疫工作中[20]。

高珺珊等[21]针对细粒棘球绦虫EdiagA864抗原制备的多克隆抗体和单克隆抗体建立的Dot-ELISA，具有较强的特异性和敏感性，与犬蛔虫和贾第虫阳性粪便无交叉反应，可用于临床检测。

2.3 金标试纸条

免疫胶体金快速诊断技术是将层析分析技术、胶体金标记技术和免疫检测技术有机的结合到一起，以胶体金自身显色结合抗原抗体特异性反应而达到检测目标的免疫标记技术[8]。与常规ELISA和Dot-ELISA相比，免疫胶体金不需要按照常规方法进行封闭、一抗二抗的孵育、底物显色这些耗时而繁琐的步骤，无需专业人员操作，也不需要特定的储存条件。随着抗体技术的成熟，免疫胶体金技术逐渐得到了完善和发展，已被广泛应用。高珺珊等[20]以标记纯化的抗EdiagA864单克隆抗体制备金标抗体，检测线包被抗EdiagA864多克隆抗体，质控线包被羊抗鼠抗体制备了细粒棘球绦虫检测胶体金试纸条，该试纸条具有良好的稳定性和特异性、无交叉反应、重复性好，可用于犬细粒棘球绦虫的临床检测及大规模流行病学调查。

随着该技术的不断发展，粪抗原检测方法也在不断完善中。首先，通过筛选一些特异性重组抗原，来代替之前的粗抗原，并使用混合检测方法可显著提高特异性和敏感性[10]。再者，由于表膜蛋白量大、易提取，因此虫体表膜抗原也有希望成为棘球绦虫检测的理想抗原之一。近几年，随着蛋白质组学的发展和应用，依赖于蛋白质组学的分子标记也逐渐引入到寄生虫病的诊断研究中，将有助于利用棘球绦虫的生物学特性寻找诊断抗原[1,22]。常规ELISA、Dot-ELISA和胶体金试纸条法各有优势，通过对已在国内上市使用的基于夹心ELISA、间接ELISA等技术开发的试剂盒评估，表明还需要进一步完善这些试剂盒的性能[23]。其中，常规ELISA和Dot-ELISA都涉及多个操作步骤。在野外或者田间工作时，胶体金技术是一种简便易行的粗筛方法，其质控问题很难量化，但随着半定量胶体金试纸条的出现将克服量化的问题。另外，敏感性不高也是金标技术存在的主要问题。

3 粪DNA检测方法

由于感染棘球绦虫的粪便中含有虫卵或虫体组织及碎片等，用粪便即可提取到寄生虫的核酸，粪DNA-PCR检测逐渐受到国内外学者的青睐[23]。近年来，已有多种粪DNA-PCR应用于棘球绦虫感染终末宿主的检测，包括常规PCR、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等。

任何一种方法，选择适宜的分子靶标是关键。为了获得理想的灵敏度，靶标DNA必须是片段较短、多拷贝或者是重复的序列。而线粒体在真核生物中大量存在，特异性强，具有较高的种间多态性[24]。通过对绦虫线粒体基因组序列的比较分析，发现线粒体NADH脱氢酶基因(nad)序列的种间序列差异大于细胞色素氧化酶基因(cox)序列，表明线粒体nad进化较快，差异更大；12个线粒体基因编码的基因中cox1基因最为保守，而nad5变异率最大，种间变异达到42.7%，nad4、atp6(ATP酶亚基6基因)、nad6基因进化较快，因此粪DNA-PCR诊断方法主要以nad基因序列为靶标[24-25]。

3.1 常规PCR

基于细粒棘球绦虫G1基因型的HaeⅢ重复序列和nad1建立的两种PCR已经被广泛应用于流行病学调查[2,26]。最新开发的基于线粒体nad6基因检测犬感染细粒棘球绦虫的粪DNA-PCR，灵敏度和特异性都很高，而且在感染后的第13天就可检测出，该方法可用于犬感染细粒棘球绦虫的早期诊断[23]。

3.2 其他PCR

随着分子生物学技术的不断发展，常规的PCR已经不能满足于不同的需求，多种PCR，如实时荧光定量PCR、多重PCR(multiplex PCR)、套式PCR(Nested PCR)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)等被逐渐开发和应用[23]。

3.2.1 实时荧光定量PCR 与常规PCR相比，实时荧光定量PCR的优势在于高敏感性和高特异性，可对样本中的DNA进行定量评估[5,27]。Knapp等基于线粒体rrnL基因(核糖体RNA大亚基，16S)开发了一种qPCR方法，可检测和定量评估狐狸粪便中释放的多房棘球绦虫DNA[28]。Øines等比较了3种不同的qPCR，并与多重PCR相比，qPCR的敏感性显著提高[29]。Maksimov P等以细粒棘球绦虫(G1-G3)和马棘球绦虫(G4)cox1基因、奥氏棘球绦虫(G5)nad5和加拿大棘球绦虫(G6-8，G10)cox3基因开发了一种可以从粪便中鉴定和区分这些种/基因型的qPCR[30]。Isaksson等针对多房棘球绦虫nad1基因和rrnS基因(核糖体RNA小亚基)设计了一种半自动磁捕获探针DNA提取方法和实时水解探针聚合酶链反应测定法(MC-PCR)，用于检测赤狐粪便样本中的多房棘球绦虫DNA，该方法具有超过88%的敏感性和99.9%特异性[30]。这项研究描述了一种从狐狸粪便中富集和提取多房棘球绦虫DNA的新方法，即富集多房棘球绦虫的DNA，以最大限度地减少由于粪便中的抑制物质的存在而对敏感性造成的影响。Riahi以线粒体rrnL(核糖体RNA大亚基)基因和nad4基因建立了一种qPCR来评估终末宿主中细粒棘球绦虫的荷虫量，在感染后第2～4周未检测到qPCR信号，表明犬粪便中未排出虫卵，从感染后第5周开始，观察到反应信号强度增加，在第7周达到最大值，这与已知的犬肠道细粒棘球绦虫的发育阶段一致[28]。

3.2.2 多重PCR Trachsel D等[29]针对nad1、cox1、rrnS的部分基因序列设计引物，建立的多重PCR可以检测到单个绦虫卵，可鉴别检测细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和绦虫属其他绦虫的混合感染。Liu C N等[30]根据nad1、nad5和cox1基因的序列设计细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫的特异性引物建立了多重PCR，能够检测从犬粪便样本中提取的虫体DNA，特异性为100%，敏感性较好，可检测到感染后第17天的多房棘球绦虫和第26天的细粒棘球绦虫[31]。针对细粒棘球绦虫atp6、多房棘球绦nad1和加拿大棘球绦虫rrnL所建立的多重PCR，在快速诊断和大规模流行病学调查方面具有优势，是一种很有前景的临床检测和流行病学调查监测工具。虽然多重PCR可以实现多基因同时检测，但由于多对引物之间的干扰，导致检测的敏感性下降[32]。

3.2.3 套式PCR Dinkel、Casulli和岳进巧等以rrnS为靶标序列建立了可用于检测棘球绦虫的套式PCR。由于套式PCR方法需要经过两次扩增，因此，与常规PCR相比，其特异性和敏感性都显著提高[32-34]。

3.2.4 PCR-RFLP 为了从带有绦虫卵的犬粪便样品中鉴定和区分细粒棘球绦虫，Hidalgo A等提出了聚合酶链反应(PCR)和多态性限制性片段(RFLP)组合的策略，针对rrnS设计一对引物进行PCR扩增，然后用特定的核酸内切酶对PCR产物进行切割，再通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，该方法特异性和敏感性都较好，易于识别细粒棘球绦虫的感染，是一种进行犬棘球绦虫感染流行病学调查的有效方法[35]。

3.2.5 新型PCR 微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术属于第3代PCR技术，是基于油包水乳化微滴技术的单分子目标基因PCR扩增绝对定量技术[36]。该技术既能对病原体定性，又能对病原体DNA或RNA序列进行绝对定量(敏感性和准确性比qPCR高)，已广泛应用于病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫病等多个领域[36]。Bago F等针对多房棘球绦虫rrnS开发了ddPCR，并结合磁捕获提取法对狐狸粪便的核酸进行提取，灵敏度为90.51%，与qPCR相比灵敏度显著提高[37]。ddPCR作为诊断不同犬科种群中多房棘球绦虫流行率以及个体动物感染强度的高通量方法显示出很强的潜力，为棘球绦虫在野生犬科动物中的分布情况提供有价值的流行病学数据，有望成为常规PCR或宏观方法的替代方法[37]。

3.3 LAMP

常规PCR或荧光定量PCR等都需要依赖相对复杂昂贵的PCR仪或荧光定量PCR仪，只适用于实验室检测，不适用于现场检测[20]。环介导等温扩增(LAMP)作为一种新兴的技术，不需要借助昂贵复杂的仪器设备和电泳分析过程，可快速的诊断/鉴定病原体，在寄生虫领域表现出理想的灵敏度和特异性，其发展前景广阔。其检测过程只需要把处理好的样本和LAMP相关试剂一起65 ℃水浴，1 h后就能通过肉眼观察结果。

陈璐等[38]以nad2基因设计引物建立了LAMP方法并与普通PCR进行了比较，灵敏度比普通PCR高出103倍，特异性较好，能够同时鉴别多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫感染，而且与其他寄生虫无交叉反应[22]。徐祥珍等[39]以细粒棘球绦虫rrnS基因建立的LAMP方法敏感性和特异性都较好。倪兴维[22]以线粒体nad5基因为靶标分子，分别建立了可用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫终末宿主感染的LAMP方法，特异性强、重复性好，与犬科动物其他常见绦虫之间均无交叉反应。该LAMP方法在多房棘球绦虫感染后第12天即可检出，在细粒棘球绦虫感染后第22天即可检出，均比PCR方法灵敏，可用于棘球绦虫感染犬早期诊断[22]。张艳艳等[40]针对cox2基因建立的LAMP诊断技术，具有良好的特异性，灵敏度是常规PCR的103倍，对犬粪中细粒棘球绦虫DNA检测结果显示，LAMP、常规PCR和粪抗原ELISA检测结果相同。Avila H J等[41]针对细粒棘球绦虫广义种cox1开发了一种新的LAMP检测方法LAMP EGSL，用于在终末宿主同时检测细粒棘球绦虫、奥氏棘球绦虫和加拿大棘球绦虫，显示出较高的灵敏性(10 fg～100 fg DNA)，且与宿主或其他蠕虫DNA无交叉反应。LAMP EGSL是棘球绦虫终末宿主犬诊断的潜在工具，可用于终末宿主的分子流行病学调查研究。

3.4 RAA

LAMP技术也存在一些缺点，一方面对引物要求较高，理想引物的筛选耗时耗力；另一方面LAMP所获得的产物是一些大小不等的片段，无法进行克隆和测序验证，仅能用于判断是否存在目的基因，且LAMP反应的高灵敏性极易受到气溶胶污染而产生假阳性结果[42]。相对于LAMP法，重组酶介导链替换核酸扩增技术(recombinase-aided isothermal amplification assay/recombinase polymerase amplification assay,RAA/RPA)扩增反应仅需1对引物，且所需时间短，更能满足快速简便的需求。周鸿让等[42-43]分别以多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫线粒体基因序列作为靶标所建立的RAA方法可在40 min内分别扩增多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫目的基因片段。该方法简便快捷，对仪器设备要求较低，37 ℃恒温条件下可完成反应。由于不受复杂仪器使用的制约，适合大量样品快速检测，特别是在现场检测中显示出较大优越性[43-44]。周鸿让等[44]又建立了一种同时检测细粒棘球绦虫(G1)和多房棘球绦虫的多重核酸等温扩增方法，可在一个反应体系中同时扩增两种棘球绦虫的基因组DNA，敏感性和特异性均较好，无交叉反应，且检测结果与PCR一致。张学勇等[45]基于RAA建立了一种能够检测出模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品(不能扩增出其他大部分绦虫)，其结果与单一PCR检测结果完全一致。

综上所述，使用粪DNA-PCR检测方法主要有两个关键因素，一是取决于提取的DNA的质量和粪便样本中抑制剂的去除；二是分子诊断方法的开发和改进。首先，为了提高检测方法的便捷性新技术不断得到应用，如LAMP、RPA/RAA等，其检测不需要昂贵的仪器，而且在较短时间内，就可以得到结果并且直接通过肉眼观察结果，可对野外流行病学调查提供便捷；其次，为了提高检测通量，采取在同一个反应体系中同时扩增多种棘球绦虫策略；为了提高检测结果的可靠性，多采取不同种粪DNA-PCR检测方法相结合，发挥每种方法的优点，如开发出一种多重套式PCR分析靶向线粒体cox1基因，区分狐狸粪便中的多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫，并与PCR-RFLP进行了比较，多重套式PCR显示出比PCR-RFLP更高的效率。

4 小结与展望

Jercic M I等[46]比较了阿根廷、智利、秘鲁和乌拉圭等国家参考实验室犬粪便细粒棘球绦虫的PCR和ELISA的检测性能，结果均表明这两种技术性能较差，敏感性和特异性较低。就针对目前的现状而言，棘球绦虫感染终末宿主粪便的检测方法仍存在一系列问题：评价检测方法时粪便样品数量是否足够多，否则结果具有一定的偶然性；荷虫量小于50条～100条的低感染可能会导致假阴性结果，而且目前定量检测方法不够成熟；粪抗原ELISA和粪DNA-PCR的结果之间符合率较低；目前大部分检查方法都需要繁琐的步骤或者昂贵的仪器或者专业人员的操作，不利于在临床上应用。因此，不仅要对检测技术进行进一步的试验优化和现场评价，还需要开发更加敏感、特异、简单快捷的检测方法。截止目前，在实际工作中，对犬进行大规模检测最实用、成本最低的策略是使用粪抗原ELISA对所有样品进行初步检测，然后结合使用粪DNA-PCR等进行补充，确认检测结果。

随着基因组学、蛋白组学等多组学技术的发展和应用，为筛选理想的诊断分子靶标提供了可能。同时，也要综合考虑棘球绦虫本身的发育特点，即虫卵、孕节、成虫期的生物学特性，从而寻找突破口。随着免疫学和分子生物学技术的不断发展，检测技术必将会日趋完善，新技术也会如雨后春笋涌现。这些检测方法的不断涌现，对最终解决终末宿主棘球绦虫感染的诊断有重要的指导意义。